A predição do desempenho de touros na produção in vitro de embriões (PIVE), pela avaliação seminal, não está plenamente estabelecida. Com este estudo, objetivou-se caracterizar as diferenças nos atributos espermáticos de touros com baixo e alto desempenho, baseado nas taxas de clivagem e de blastocisto, visando estabelecer métodos preditivos de maior eficiência na PIVE. A partir do histórico de três anos da empresa In Vitro Brasil®, foram selecionados touros que haviam resultado nas menores e maiores taxas de clivagem e de blastocisto, estabelecendo-se 4 grupos experimentais: baixa taxa de clivagem (BC, n=5), alta taxa de clivagem (AC, n=5), baixa taxa de blastocisto (BB, n=5) e alta taxa de blastocisto (AB, n=5). Foram adquiridas palhetas de sêmen congelado dos touros de cada grupo, nas quais foram avaliados, antes (Pré-Percoll®) e após centrifugação em gradiente de Percoll® (Pós-Percoll®), os atributos espermáticos: cinética, em sistema CASA; integridade de membranas plasmática e acrossomal (FITC-PSA/PI), potencial de membrana mitocondrial (JC-1), status oxidativo (DHE, CellROXTM green/PI, MitoSox red), apoptose (FITC-FMK-VAD/PI) e DNA (SCSA), por citometria de fluxo; morfologia; atividade mitocondrial (DAB); capacitação (CTC); teste funcional e TBARS induzido. Diferenças entre grupos (BC vs. AC e BB vs. AB) foram estimadas pelo teste t. Para todas as análises estatísticas foi considerado nível de significância de 5%. Na ausência de interações significativas, o efeito dos grupos foi analisado ao fundir os momentos Pré e Pós-Percoll®. Os grupos AC e AB apresentaram valores superiores de VAP, VCL, ALH e DNC e valores inferiores de BCF, STR, LIN e WOB, cinética indicativa de hiperativação. Adicionalmente, estes grupos apresentaram indícios de menor ocorrência de estresse oxidativo, evidenciados pelo percentual de espermatozoides com membrana lesada e estresse oxidativo (CellROXTM green/PI) no grupo AC e nível de DHE no grupo AB. Para os demais atributos estudados, não se obteve diferença entre os grupos. Por meio de análise de regressão logística multivariada, constatou-se que a taxa de clivagem sofre efeito de: VCL, BCF e percentual de espermatozoides com integridade de membrana e sem estresse oxidativo; já a taxa de blastocisto, sofre efeito de: defeitos menores, VSL, DABIII e DHE, os quais foram inclusos nos respectivos modelos preditivos. As taxas obtidas com o modelo preditivo foram comparadas às taxas reais por análise de correlação de Pearson, que resultaram em intensidade moderada tanto para clivagem (r=0,56) quanto para blastocisto (r=0,44). Subpopulações espermáticas com diferentes perfis de cinética em CASA, foram determinadas em três etapas estatísticas segundo Núñez-Martínez et al. (2006). Foram detectadas 4 subpopulações: 1-Rápidos e progressivos; 2- Hiperativados; 3- Lentos e sinuosos; 4- Lentos e progressivos. Touros com alto desempenho (AC e AB) apresentaram maior percentual de subpopulação 2, Pré-Percoll®, e das subpopulações 1 e 2, Pós-Percoll®. Com isto, demonstra-se ser possível diferenciar touros de baixo e alto desempenho na PIVE, pela avaliação dos atributos espermáticos, com o estabelecimento de modelos preditivos para as taxas de clivagem e de blastocisto. Ademais, o estudo das subpopulações espermáticas constitui-se no método mais efetivo para a predição do desempenho in vitro. / The prediction of bull performance on the in vitro production (IVP) of bovine embryos, by the seminal evaluation, is not fully established. Thus, the aim of this study was to characterize the differences in the sperm features of bulls with low and high performance, based on cleavage and blastocyst rates, in order to establish predictive methods for a greater efficiency in the IVP. Based on the results obtained in three years from the company In Vitro Brasil®, bulls were selected by the lowest and highest cleavage and blastocyst rates, establishing 4 experimental groups: low cleavage rate (BC, n=5), high cleavage rate (AC, n=5), low blastocyst rate (BB, n=5) and high blastocyst rate (AB, n=5). Frozen semen were obtained from the bulls of each group, in which were evaluated, before (Pre-Percoll®) and after Percoll® gradient centrifugation (Post-Percoll®), the sperm features: kinetics, in CASA; integrity of plasma and acrosomal membranes (FITC-PSA/PI), mitochondrial membrane potential (JC-1), oxidative status (DHE, CellROXTM green/PI, MitoSox red), apoptosis (FITC-FMK-VAD/PI) and DNA (SCSA), by flow cytometry; morphology; mitochondrial activity (DAB); capacitation (CTC); functional test and induced TBARS. Differences between groups (BC vs. AC and BB vs. AB) were estimated by t test. A significance level of 5% was considered for all statistical analysis. In the absence of significant interactions, the effect of the groups was analyzed by merging the moments Pre and Post-Percoll®. The AC and AB groups presented higher values of VAP, VCL, ALH and DNC and lower values of BCF, STR, LIN and WOB, kinetics indicative of hyperactivation. In addition, these groups showed less evidence of oxidative stress, observed by the percentage of spermatozoa with damaged membrane and oxidative stress (CellROXTM green/PI) in the AC group and level of DHE in the AB group. For the others sperm features, there was no difference between groups. By multivariate logistic regression analysis, it was verified that the cleavage rate is affected by: VSL, BCF and percentage of spermatozoa with membrane integrity and without oxidative stress; and the blastocyst rate, is affected by: minor defects, VSL, DABIII and DHE, which were included in the respective predictive models. The rates obtained with the predictive model were compared to the real rates by Pearson correlation analysis, which resulted in moderate intensity for both cleavage (r=0.56) and blastocyst (r=0.44). Spermatic subpopulations with different kinetic profiles at CASA were determined in three statistical steps according to Núñez-Martínez et al. (2006). Four subpopulations were detected: 1-Fast and progressive; 2- Hyperactivated; 3- Slow and sinuous; 4- Slow and progressive. Bulls with high performance (AC and AB) presented higher percentage of subpopulation 2, Pre-Percoll®, and subpopulations 1 and 2, Post-Percoll®. In summary, it is possible to differentiate low and high-performance bulls at IVP by evaluating the sperm features, with the establishment of predictive models for the cleavage and blastocyst rates. Furthermore, the study of sperm subpopulations is the most effective method for predicting in vitro performance.

A predição do desempenho de touros na produção in vitro de embriões (PIVE), pela avaliação seminal, não está plenamente estabelecida. Com este estudo, objetivou-se caracterizar as diferenças nos atributos espermáticos de touros com baixo e alto desempenho, baseado nas taxas de clivagem e de blastocisto, visando estabelecer métodos preditivos de maior eficiência na PIVE. A partir do histórico de três anos da empresa In Vitro Brasil®, foram selecionados touros que haviam resultado nas menores e maiores taxas de clivagem e de blastocisto, estabelecendo-se 4 grupos experimentais: baixa taxa de clivagem (BC, n=5), alta taxa de clivagem (AC, n=5), baixa taxa de blastocisto (BB, n=5) e alta taxa de blastocisto (AB, n=5). Foram adquiridas palhetas de sêmen congelado dos touros de cada grupo, nas quais foram avaliados, antes (Pré-Percoll®) e após centrifugação em gradiente de Percoll® (Pós-Percoll®), os atributos espermáticos: cinética, em sistema CASA; integridade de membranas plasmática e acrossomal (FITC-PSA/PI), potencial de membrana mitocondrial (JC-1), status oxidativo (DHE, CellROXTM green/PI, MitoSox red), apoptose (FITC-FMK-VAD/PI) e DNA (SCSA), por citometria de fluxo; morfologia; atividade mitocondrial (DAB); capacitação (CTC); teste funcional e TBARS induzido. Diferenças entre grupos (BC vs. AC e BB vs. AB) foram estimadas pelo teste t. Para todas as análises estatísticas foi considerado nível de significância de 5%. Na ausência de interações significativas, o efeito dos grupos foi analisado ao fundir os momentos Pré e Pós-Percoll®. Os grupos AC e AB apresentaram valores superiores de VAP, VCL, ALH e DNC e valores inferiores de BCF, STR, LIN e WOB, cinética indicativa de hiperativação. Adicionalmente, estes grupos apresentaram indícios de menor ocorrência de estresse oxidativo, evidenciados pelo percentual de espermatozoides com membrana lesada e estresse oxidativo (CellROXTM green/PI) no grupo AC e nível de DHE no grupo AB. Para os demais atributos estudados, não se obteve diferença entre os grupos. Por meio de análise de regressão logística multivariada, constatou-se que a taxa de clivagem sofre efeito de: VCL, BCF e percentual de espermatozoides com integridade de membrana e sem estresse oxidativo; já a taxa de blastocisto, sofre efeito de: defeitos menores, VSL, DABIII e DHE, os quais foram inclusos nos respectivos modelos preditivos. As taxas obtidas com o modelo preditivo foram comparadas às taxas reais por análise de correlação de Pearson, que resultaram em intensidade moderada tanto para clivagem (r=0,56) quanto para blastocisto (r=0,44). Subpopulações espermáticas com diferentes perfis de cinética em CASA, foram determinadas em três etapas estatísticas segundo Núñez-Martínez et al. (2006). Foram detectadas 4 subpopulações: 1-Rápidos e progressivos; 2- Hiperativados; 3- Lentos e sinuosos; 4- Lentos e progressivos. Touros com alto desempenho (AC e AB) apresentaram maior percentual de subpopulação 2, Pré-Percoll®, e das subpopulações 1 e 2, Pós-Percoll®. Com isto, demonstra-se ser possível diferenciar touros de baixo e alto desempenho na PIVE, pela avaliação dos atributos espermáticos, com o estabelecimento de modelos preditivos para as taxas de clivagem e de blastocisto. Ademais, o estudo das subpopulações espermáticas constitui-se no método mais efetivo para a predição do desempenho in vitro. / The prediction of bull performance on the in vitro production (IVP) of bovine embryos, by the seminal evaluation, is not fully established. Thus, the aim of this study was to characterize the differences in the sperm features of bulls with low and high performance, based on cleavage and blastocyst rates, in order to establish predictive methods for a greater efficiency in the IVP. Based on the results obtained in three years from the company In Vitro Brasil®, bulls were selected by the lowest and highest cleavage and blastocyst rates, establishing 4 experimental groups: low cleavage rate (BC, n=5), high cleavage rate (AC, n=5), low blastocyst rate (BB, n=5) and high blastocyst rate (AB, n=5). Frozen semen were obtained from the bulls of each group, in which were evaluated, before (Pre-Percoll®) and after Percoll® gradient centrifugation (Post-Percoll®), the sperm features: kinetics, in CASA; integrity of plasma and acrosomal membranes (FITC-PSA/PI), mitochondrial membrane potential (JC-1), oxidative status (DHE, CellROXTM green/PI, MitoSox red), apoptosis (FITC-FMK-VAD/PI) and DNA (SCSA), by flow cytometry; morphology; mitochondrial activity (DAB); capacitation (CTC); functional test and induced TBARS. Differences between groups (BC vs. AC and BB vs. AB) were estimated by t test. A significance level of 5% was considered for all statistical analysis. In the absence of significant interactions, the effect of the groups was analyzed by merging the moments Pre and Post-Percoll®. The AC and AB groups presented higher values of VAP, VCL, ALH and DNC and lower values of BCF, STR, LIN and WOB, kinetics indicative of hyperactivation. In addition, these groups showed less evidence of oxidative stress, observed by the percentage of spermatozoa with damaged membrane and oxidative stress (CellROXTM green/PI) in the AC group and level of DHE in the AB group. For the others sperm features, there was no difference between groups. By multivariate logistic regression analysis, it was verified that the cleavage rate is affected by: VSL, BCF and percentage of spermatozoa with membrane integrity and without oxidative stress; and the blastocyst rate, is affected by: minor defects, VSL, DABIII and DHE, which were included in the respective predictive models. The rates obtained with the predictive model were compared to the real rates by Pearson correlation analysis, which resulted in moderate intensity for both cleavage (r=0.56) and blastocyst (r=0.44). Spermatic subpopulations with different kinetic profiles at CASA were determined in three statistical steps according to Núñez-Martínez et al. (2006). Four subpopulations were detected: 1-Fast and progressive; 2- Hyperactivated; 3- Slow and sinuous; 4- Slow and progressive. Bulls with high performance (AC and AB) presented higher percentage of subpopulation 2, Pre-Percoll®, and subpopulations 1 and 2, Post-Percoll®. In summary, it is possible to differentiate low and high-performance bulls at IVP by evaluating the sperm features, with the establishment of predictive models for the cleavage and blastocyst rates. Furthermore, the study of sperm subpopulations is the most effective method for predicting in vitro performance.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Resumo: As tecnologias de reprodução assistida ou ARTs (“Assisted Reproductive Technology”) são amplamente utilizadas na reprodução humana e animal. Para estes procedimentos, gametas e embriões são expostos a um ambiente artificial que mimetiza o trato reprodutivo. Um dos fatores mais discrepantes neste contexto é a atmosfera gasosa, visto que in vivo a concentração de O2 encontrada no trato reprodutivo é menor do que a utilizada no ambiente in vitro, sendo comumente utilizada a concentração de 20% de oxigênio neste sistema artificial. Altas concentrações deste gás provocam estresse oxidativo e aumento das concentrações de espécies reativas de oxigênio (EROs) e, consequente maior proporção de células apoptóticas em oócitos e embriões. Entretanto, pouco se sabe sobre as consequências da mudança de atmosfera gasosa durante as fases iniciais da produção in vitro de embriões e as possíveis consequências no remodelamento epigenético. Para validar a hipótese de que diferentes concentrações de oxigênio durante a maturação e a fecundação in vitro modulam a transcrição de genes envolvidos no estresse oxidativo e modeladores epigenéticos em oócitos, células do cumulus e embriões bovinos. Além disso, o estresse oxidativo gerado nos embriões exerce efeito sobre os níveis globais de metilação do DNA e marcas de histonas, cinco experimentos foram realizados com objetivo de investigar o papel da atmosfera gasosa nos passos iniciais da produção in vitro de embriões bovinos. Para diferenciar os efeit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O presente estudo foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal da Empresa Agropecuária Laffranchi Com. Ind. LTDA, localizada no município de Tamarana - Paraná. O experimento se refere aos resultados obtidos na produção in vitro de embriões através da aspiração folicular transvaginal em bovinos das raças Nelore (não CEIP, Bos indicus, n = 34), Nelore (CEIP, Bos indicus, n = 22). Brangus (5/8 Bos taurus x 3/8 Bos indicus, n = 64) e Girolando (5/8 Bos taurus x 3/8 Bos indicus, n = 52) totalizando 172 animais, no período de O 1 janeiro de 2010 a 31 de dezembro de 2012. Todos os animais foram submetidos à OPU (Ovum Pick Up) totalizando 397 procedimentos entre as doadoras, sendo 104 OPUs em Nelore (não CEIP), 52 OPUs em Nelore (CEIP). 133 OPUs em Brangus e 108 OPUs em Girolando. Com estes procedimentos foram aspirados 7335 oócitos, destes 3597 foram considerados viáveis (49%), produzindo 969 embriões (26.93%), destes foram transferidos 922 embriões em receptoras previamente selecionadas, resultando em 266 prenhes (taxa de prenhes 28.85%). Após a obtenção dos oócitos estes eram enviados para o laboratório acima citado para maturação, fecundação e cultivo in vitro, em um período de oito dias. Os embriões produzidos eram transferidos para receptoras de embrião previamente selecionadas e submetidas ao protocolo de TETF (transferência de embrião em tempo fixo), sendo o diagnóstico de gestação realizado aos 30 dias com auxílio de ultrassonografia transretal. Na raça Brangus recuperou-se um total de 2139 oócitos sendo 967 viáveis (45,2%), destes foram obtidos 272 embriões os quais foram transferidos 241 embriões resultando em 81 prenhezes (33.3%). Na raça Girolando, foram recuperados 1806 oócitos, destes 972 foram considerados viáveis (53.8%) e resultaram na produção de 251 embriões (25.8%), os quais foram transferidos 245, obtendo-se 61 prenhezes (24.9%). Com relação às doadoras da raça Nelore (CEIP). recuperou-se 1850 oócitos, destes 842 foram considerados viáveis (45.5%), resultando em 214 embriões (25.4%), obtendo-se 61 prenhezes (28.5%). Na raça Nelore (não CEIP) recuperou-se 1540 oócitos sendo 816 considerados viáveis (53.0%), os quais resultaram na produção de 232 embriões (28.4%), sendo transferidos 222 dos quais se obteve 63 prenhezes (28.4%). De acordo com a análise estatística observou-se que a raça Nelore (CEIP) teve resultados superiores de (P< 0.0001) em relação à média total de oócitos por OPU, total de oócitos viáveis por sessão de OPU (P< 0.0001), produção de embriões (P< 0.0001) e prenhes por OPU (P<O,0115). O presente trabalho forneceu dados inéditos de PIVE para discussão nas raças sintéticas Brangus e Girolando ( Bos taurus x Bos indicus), em larga escala, porém, o experimento também destaca a necessidade de mais estudos relacionados à produção in vitro de embriões nessas raças. Quanto ao comparativo entre as raças, observou que a quantidade total de oócitos não variou de acordo com as raças Brangus, Girolando e Nelore (não CEIP), no entanto podemos notar uma grande variação individual de animais da mesma raça, Nelore (CEIP) e Nelore (não CEIP), onde se obteve nas fêmeas da raça Nelore (CEIP, selecionadas) uma maior produção total de oócitos, oócitos viáveis e embriões por sessão de aspiração. / This study was developed at the Laboratory of Animal Reproduction from the \"Empresa Agropecuária Laffranchi Com. Ind. LTDA\", town of Tamarana, Paraná State, Brazil. Results from in vitro production of cattle embryos through follicular aspiration in the breeds Nelore (no CEIP, Bos indicus, n = 34), Nelore (CEIP, Bos indicus, n = 22), Brangus (5/8 Bos taurus x 3/8 Bos indicus, n = 64) e Girolando (5/8 Bos taurus x 3/8 Bos indicus, n = 52) from January 1st of 2010 to December 31th of 2012 were used totalizing 397 oocyte donors OPU. From those, 104 OPU were realized in Nelore (no CEIP), 52 OPUs in Nelore (CEIP), 133 OPUs in Brangus, and 108 OPUs in Girolando. The total of recovered oocytes was 7335. Then, the oocytes were sent to the Laboratory for in vitro maturation, fertilization and culture during a period of eight days. The number ofviable oocytes was 3597 (49%) and 969 embryos were in vitro produced (26.9%). A total of 922 were transferred to recipients previously selected and submitted to estrous synchronization using the farm routine FTET (fixed-time embryo transfer) protocol. The pregnancy rate was 28.9% (266 pregnancies). Pregnancy diagnosis was done at the embryo age of 30 days using B-mode transrectal ultrasonography. From Brangus cows, a total of 2139 oocytes were recovered and 967 were c1assified as viable (45.2%), 272 embryos were produced and 241 were transferred resulting in 81 pregnancies (33.3%). From Girolando cows, 1806 oocytes were recovered and 972 c1assified as viable (53.8%). A total of 251 embryos (25.8%) were produced, 245 transferred and the pregnancy rate was 24.9% (61 pregnancies).From the Nelore CEIP cows, a total of 1850 oocytes were recovered and 842 were c1assified as viable (45.5%), 214 embryos were produced and 214 were transferred resulting in 61 pregnancies (28.5%).From Nelore cows, 1540 oocytes were recovered and 816 c1assified as viable (53.0%). A total of 232 embryos (28.4%) were produced, 222 transferred and the pregnancy rate was 28.4% (63 pregnancies).The Nelore CEIP presented superior results for the number of oocytes recovered per OPU (P<0.0001), for the total of viable oocytes per OPU (P<0.0001), embryos produced (P<0.0001), and total of pregnancies per OPU procedures (P<0.0115). This work presents for the first time data from IVPE from Brangus and Girolando breeds (Bos taurosx Bos indicus). When the four studied breeds were compared, the results showed a considerable variation between animais in the same breed. Also, it was observed, in the same breed Nelore, a superiority ofthe Nelore CEIP for oocyte recovery rate, viable oocytes e total of embryos produced by OPU procedure.

Nos últimos anos, o emprego da aspiração folicular (OPU) e produção in vitro de embriões (PIVE) têm crescido mundialmente nos rebanhos bovinos. A OPU-PIVE viabiliza a rápida multiplicação do material genético, utilizando tanto a base genética da fêmea como do macho. No entanto, fêmeas de leite Bos taurus apresentam algumas peculiaridades, como menor população de folículos antrais e inferior qualidade oocitária, as quais foram apontadas como fatores responsáveis pela reduzida eficiência da técnica nesses rebanhos. Frente às dificuldades para o estabelecimento de programas de OPU-PIVE eficientes em vacas de leite Bos taurus, três experimentos foram conduzidos envolvendo diferentes tipos de tratamentos superestimulatórios em doadoras de oócitos lactantes e não lactantes. O primeiro estudo teve como objetivo aumentar a PIVE em doadoras da raça Holandesa lactantes e não lactantes submetidas ao tratamento tradicional de superstimulação com doses decrescentes de FSH porcino (FSHp) a cada 12 h, previamente à OPU. Nesse estudo, as doadoras (n = 15 vacas lactantes e n = 15 não lactantes da raça Holandesa) receberam protocolo para sincronização da emergência da onda folicular [protocolo a base de benzoato de estradiol (BE) e progesterona (P4)] e foram submetidas aos tratamentos de superestimulação em um delineamento experimental cross-over. Os outros dois estudos (n = 23 novilhas da raça Holandesa e n = 72 vacas não lactantes da raça Holandesa) foram desenvolvidos para avaliar diferentes diluentes para o FSHp com o objetivo de viabilizar a superestimulação com apenas uma aplicação de FSHp. No geral, os estudos avaliaram o efeito da superestimulação no perfil plasmático de FSH, na proporção de folículos classificados como pequenos (<6mm), médios (6-10mm) ou grandes (>10mm), conforme diâmetro folicular, na PIVE e no estabelecimento gestacional após transferência de embriões. A superestimulação aumentou a proporção de folículos médios, aumentou a competência oocitária e resultou em maior produção de blastocistos por sessão de OPU. A aplicação única de FSHp associado ao diluente de liberação lenta (ácido hialurônico), resultou em semelhante área sob a curva de FSH, semelhante proporção de folículos pequenos, médios e grandes e semelhante PIVE comparado ao tratamento superestimulatório tradicional com doses de FSHp administradas a cada 12h. Independentemente do diluente e da dose de FSHp utilizada, o tratamento superestimulatório resultou em maior produção de blastocistos por sessão de OPU comparado às vacas não tratadas com FSHp. Adicionalmente, semelhante taxa de estabelecimento gestacional foi observada, independentemente do tratamento utilizado na doadora. Portanto, os dados obtidos no presente estudo permitem concluir que independentemente do tipo de tratamento (diluente para FSHp ou dose utilizada de FSHp), a superestimulação previamente ao processo de OPU, aumentou o desenvolvimento de embriões in vitro, número de blastocistos por sessão de OPU e resultando em semelhante taxa de estabelecimento gestacional após transferência de embriões. / In the last years, the use of ovum pick-up (OPU) and in vitro produced embryo (IVEP) technology has worldwide increased in cattle herds. The OPU-IVEP enable a rapid individual multiplication based on the female and male donor genetic. However, Bos taurus dairy females present some peculiarities, as reduced antral follicle population and lower oocyte quality, and these factors have been awarded as responsible to the reduced technique efficiency among these herds. Given the difficulties of establishing OPU-IVEP programs with high efficiency in Bos taurus dairy cows, three studies were carried out, involving different types of superstimulation treatments in lactating and non-lactating Holstein donors. The first study aimed to increase IVEP in lactating and non-lactating Holstein dairy donors submitted to the traditional twice-daily porcine FSH (pFSH) superstimulation treatment prior to the OPU. For this purpose, donors (n = 15 lactating and n = 15 non-lactating Holstein cows) received the follicular wave synchronization protocol [estradiol benzoate (EB) and progesterone (P4) based protocol] and were submitted to superstimulation treatment in a cross-over design. Other two experiments were performed (n = 23 Holstein heifers and n = 72 non-lactating Holstein cows) to evaluate different pFSH diluents to enable superstimulation with a single injection. In general, these studies evaluated the effect of superstimulation on the plasmatic FSH profile, proportion of follicles sizes previous to OPU (small: <6mm; medium: 6-10mm; and large follicles: >10mm), on in vitro embryo production and pregnancy establishment after the produced embryo transfer. The superstimulation treatment improved the proportion of medium sized-follicles, improved oocyte competence and resulted in greater amount of blastocyst per OPU session. A single injection of pFSH combined with a slow release carrier (hyaluronan), resulted in similar FSH area under curve, proportion of follicles sizes previous to OPU and in vitro embryo production compared to the twice-daily superstimulating treatment. Regardless pFSH diluent and dose, superstimulating hormone resulted in greater number of blastocysts per OPU session compared to the non-pFSH treated donors. Additionally, similar pregnancy establishment was observed, regardless embryo donor treatment. Therefore, with the present data, we can conclude that regardless treatment type (pFSH diluent or dose), the superstimulation procedure prior to the OPU, enhanced in vitro embryo development, increased the number of blastocyst per OPU session and resulted in similar pregnancy establishment after embryo transfer.

Nos últimos anos, o emprego da aspiração folicular (OPU) e produção in vitro de embriões (PIVE) têm crescido mundialmente nos rebanhos bovinos. A OPU-PIVE viabiliza a rápida multiplicação do material genético, utilizando tanto a base genética da fêmea como do macho. No entanto, fêmeas de leite Bos taurus apresentam algumas peculiaridades, como menor população de folículos antrais e inferior qualidade oocitária, as quais foram apontadas como fatores responsáveis pela reduzida eficiência da técnica nesses rebanhos. Frente às dificuldades para o estabelecimento de programas de OPU-PIVE eficientes em vacas de leite Bos taurus, três experimentos foram conduzidos envolvendo diferentes tipos de tratamentos superestimulatórios em doadoras de oócitos lactantes e não lactantes. O primeiro estudo teve como objetivo aumentar a PIVE em doadoras da raça Holandesa lactantes e não lactantes submetidas ao tratamento tradicional de superstimulação com doses decrescentes de FSH porcino (FSHp) a cada 12 h, previamente à OPU. Nesse estudo, as doadoras (n = 15 vacas lactantes e n = 15 não lactantes da raça Holandesa) receberam protocolo para sincronização da emergência da onda folicular [protocolo a base de benzoato de estradiol (BE) e progesterona (P4)] e foram submetidas aos tratamentos de superestimulação em um delineamento experimental cross-over. Os outros dois estudos (n = 23 novilhas da raça Holandesa e n = 72 vacas não lactantes da raça Holandesa) foram desenvolvidos para avaliar diferentes diluentes para o FSHp com o objetivo de viabilizar a superestimulação com apenas uma aplicação de FSHp. No geral, os estudos avaliaram o efeito da superestimulação no perfil plasmático de FSH, na proporção de folículos classificados como pequenos (<6mm), médios (6-10mm) ou grandes (>10mm), conforme diâmetro folicular, na PIVE e no estabelecimento gestacional após transferência de embriões. A superestimulação aumentou a proporção de folículos médios, aumentou a competência oocitária e resultou em maior produção de blastocistos por sessão de OPU. A aplicação única de FSHp associado ao diluente de liberação lenta (ácido hialurônico), resultou em semelhante área sob a curva de FSH, semelhante proporção de folículos pequenos, médios e grandes e semelhante PIVE comparado ao tratamento superestimulatório tradicional com doses de FSHp administradas a cada 12h. Independentemente do diluente e da dose de FSHp utilizada, o tratamento superestimulatório resultou em maior produção de blastocistos por sessão de OPU comparado às vacas não tratadas com FSHp. Adicionalmente, semelhante taxa de estabelecimento gestacional foi observada, independentemente do tratamento utilizado na doadora. Portanto, os dados obtidos no presente estudo permitem concluir que independentemente do tipo de tratamento (diluente para FSHp ou dose utilizada de FSHp), a superestimulação previamente ao processo de OPU, aumentou o desenvolvimento de embriões in vitro, número de blastocistos por sessão de OPU e resultando em semelhante taxa de estabelecimento gestacional após transferência de embriões. / In the last years, the use of ovum pick-up (OPU) and in vitro produced embryo (IVEP) technology has worldwide increased in cattle herds. The OPU-IVEP enable a rapid individual multiplication based on the female and male donor genetic. However, Bos taurus dairy females present some peculiarities, as reduced antral follicle population and lower oocyte quality, and these factors have been awarded as responsible to the reduced technique efficiency among these herds. Given the difficulties of establishing OPU-IVEP programs with high efficiency in Bos taurus dairy cows, three studies were carried out, involving different types of superstimulation treatments in lactating and non-lactating Holstein donors. The first study aimed to increase IVEP in lactating and non-lactating Holstein dairy donors submitted to the traditional twice-daily porcine FSH (pFSH) superstimulation treatment prior to the OPU. For this purpose, donors (n = 15 lactating and n = 15 non-lactating Holstein cows) received the follicular wave synchronization protocol [estradiol benzoate (EB) and progesterone (P4) based protocol] and were submitted to superstimulation treatment in a cross-over design. Other two experiments were performed (n = 23 Holstein heifers and n = 72 non-lactating Holstein cows) to evaluate different pFSH diluents to enable superstimulation with a single injection. In general, these studies evaluated the effect of superstimulation on the plasmatic FSH profile, proportion of follicles sizes previous to OPU (small: <6mm; medium: 6-10mm; and large follicles: >10mm), on in vitro embryo production and pregnancy establishment after the produced embryo transfer. The superstimulation treatment improved the proportion of medium sized-follicles, improved oocyte competence and resulted in greater amount of blastocyst per OPU session. A single injection of pFSH combined with a slow release carrier (hyaluronan), resulted in similar FSH area under curve, proportion of follicles sizes previous to OPU and in vitro embryo production compared to the twice-daily superstimulating treatment. Regardless pFSH diluent and dose, superstimulating hormone resulted in greater number of blastocysts per OPU session compared to the non-pFSH treated donors. Additionally, similar pregnancy establishment was observed, regardless embryo donor treatment. Therefore, with the present data, we can conclude that regardless treatment type (pFSH diluent or dose), the superstimulation procedure prior to the OPU, enhanced in vitro embryo development, increased the number of blastocyst per OPU session and resulted in similar pregnancy establishment after embryo transfer.

O presente estudo foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal da Empresa Agropecuária Laffranchi Com. Ind. LTDA, localizada no município de Tamarana - Paraná. O experimento se refere aos resultados obtidos na produção in vitro de embriões através da aspiração folicular transvaginal em bovinos das raças Nelore (não CEIP, Bos indicus, n = 34), Nelore (CEIP, Bos indicus, n = 22). Brangus (5/8 Bos taurus x 3/8 Bos indicus, n = 64) e Girolando (5/8 Bos taurus x 3/8 Bos indicus, n = 52) totalizando 172 animais, no período de O 1 janeiro de 2010 a 31 de dezembro de 2012. Todos os animais foram submetidos à OPU (Ovum Pick Up) totalizando 397 procedimentos entre as doadoras, sendo 104 OPUs em Nelore (não CEIP), 52 OPUs em Nelore (CEIP). 133 OPUs em Brangus e 108 OPUs em Girolando. Com estes procedimentos foram aspirados 7335 oócitos, destes 3597 foram considerados viáveis (49%), produzindo 969 embriões (26.93%), destes foram transferidos 922 embriões em receptoras previamente selecionadas, resultando em 266 prenhes (taxa de prenhes 28.85%). Após a obtenção dos oócitos estes eram enviados para o laboratório acima citado para maturação, fecundação e cultivo in vitro, em um período de oito dias. Os embriões produzidos eram transferidos para receptoras de embrião previamente selecionadas e submetidas ao protocolo de TETF (transferência de embrião em tempo fixo), sendo o diagnóstico de gestação realizado aos 30 dias com auxílio de ultrassonografia transretal. Na raça Brangus recuperou-se um total de 2139 oócitos sendo 967 viáveis (45,2%), destes foram obtidos 272 embriões os quais foram transferidos 241 embriões resultando em 81 prenhezes (33.3%). Na raça Girolando, foram recuperados 1806 oócitos, destes 972 foram considerados viáveis (53.8%) e resultaram na produção de 251 embriões (25.8%), os quais foram transferidos 245, obtendo-se 61 prenhezes (24.9%). Com relação às doadoras da raça Nelore (CEIP). recuperou-se 1850 oócitos, destes 842 foram considerados viáveis (45.5%), resultando em 214 embriões (25.4%), obtendo-se 61 prenhezes (28.5%). Na raça Nelore (não CEIP) recuperou-se 1540 oócitos sendo 816 considerados viáveis (53.0%), os quais resultaram na produção de 232 embriões (28.4%), sendo transferidos 222 dos quais se obteve 63 prenhezes (28.4%). De acordo com a análise estatística observou-se que a raça Nelore (CEIP) teve resultados superiores de (P< 0.0001) em relação à média total de oócitos por OPU, total de oócitos viáveis por sessão de OPU (P< 0.0001), produção de embriões (P< 0.0001) e prenhes por OPU (P<O,0115). O presente trabalho forneceu dados inéditos de PIVE para discussão nas raças sintéticas Brangus e Girolando ( Bos taurus x Bos indicus), em larga escala, porém, o experimento também destaca a necessidade de mais estudos relacionados à produção in vitro de embriões nessas raças. Quanto ao comparativo entre as raças, observou que a quantidade total de oócitos não variou de acordo com as raças Brangus, Girolando e Nelore (não CEIP), no entanto podemos notar uma grande variação individual de animais da mesma raça, Nelore (CEIP) e Nelore (não CEIP), onde se obteve nas fêmeas da raça Nelore (CEIP, selecionadas) uma maior produção total de oócitos, oócitos viáveis e embriões por sessão de aspiração. / This study was developed at the Laboratory of Animal Reproduction from the \"Empresa Agropecuária Laffranchi Com. Ind. LTDA\", town of Tamarana, Paraná State, Brazil. Results from in vitro production of cattle embryos through follicular aspiration in the breeds Nelore (no CEIP, Bos indicus, n = 34), Nelore (CEIP, Bos indicus, n = 22), Brangus (5/8 Bos taurus x 3/8 Bos indicus, n = 64) e Girolando (5/8 Bos taurus x 3/8 Bos indicus, n = 52) from January 1st of 2010 to December 31th of 2012 were used totalizing 397 oocyte donors OPU. From those, 104 OPU were realized in Nelore (no CEIP), 52 OPUs in Nelore (CEIP), 133 OPUs in Brangus, and 108 OPUs in Girolando. The total of recovered oocytes was 7335. Then, the oocytes were sent to the Laboratory for in vitro maturation, fertilization and culture during a period of eight days. The number ofviable oocytes was 3597 (49%) and 969 embryos were in vitro produced (26.9%). A total of 922 were transferred to recipients previously selected and submitted to estrous synchronization using the farm routine FTET (fixed-time embryo transfer) protocol. The pregnancy rate was 28.9% (266 pregnancies). Pregnancy diagnosis was done at the embryo age of 30 days using B-mode transrectal ultrasonography. From Brangus cows, a total of 2139 oocytes were recovered and 967 were c1assified as viable (45.2%), 272 embryos were produced and 241 were transferred resulting in 81 pregnancies (33.3%). From Girolando cows, 1806 oocytes were recovered and 972 c1assified as viable (53.8%). A total of 251 embryos (25.8%) were produced, 245 transferred and the pregnancy rate was 24.9% (61 pregnancies).From the Nelore CEIP cows, a total of 1850 oocytes were recovered and 842 were c1assified as viable (45.5%), 214 embryos were produced and 214 were transferred resulting in 61 pregnancies (28.5%).From Nelore cows, 1540 oocytes were recovered and 816 c1assified as viable (53.0%). A total of 232 embryos (28.4%) were produced, 222 transferred and the pregnancy rate was 28.4% (63 pregnancies).The Nelore CEIP presented superior results for the number of oocytes recovered per OPU (P<0.0001), for the total of viable oocytes per OPU (P<0.0001), embryos produced (P<0.0001), and total of pregnancies per OPU procedures (P<0.0115). This work presents for the first time data from IVPE from Brangus and Girolando breeds (Bos taurosx Bos indicus). When the four studied breeds were compared, the results showed a considerable variation between animais in the same breed. Also, it was observed, in the same breed Nelore, a superiority ofthe Nelore CEIP for oocyte recovery rate, viable oocytes e total of embryos produced by OPU procedure.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-10-11T14:31:19Z No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-15T11:00:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-15T11:00:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-09-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Chemical delipidation has been used as an alternative to improve the cryotolerance of in vitro produced embryos (IVP). The aim of this study was evaluate the effect of L-carnitine (LC) on the development and survival of vitrified IVP bovine embryos by the Cryotop method in the first assay, and in the second trial the effect of LC and Forskolin on Cryotop cryopreserved embryos Experiment 1), or by modified slow freezing (Experiment 2), so mitochondrial activity, intracytoplasmic lipid (LI) content, cellular apoptosis (NCA) and hatching after heating were evaluated. In the first essay LC was used at the concentration of 0,6 mg/mL in maturation culture medium (IVM), embryo culture (IVC) and / or post-thawing (REC), in four treatments: without LC (Control), LC added to CIV (LCiv), LC to CIV + LC to REC (LCivR), and LC to MIV / CIV + LC to REC (LMivCR). The addition of LC increased the production of blastocysts in D7 by 28.6% (LCiv) and the amount of embryos grade I by 36.9% (LCivR), the re-expansion rate in 22,7% and hatching in 20.1% (LCiv), and mitochondrial activity was 1.9 times higher (P <0.001) (LCivR) than Control. The LI quantity was 29% lower in LCiv and LCivR and 50.2% in LMivCR compared Control (P <0.001). In the second experiment the embryos were cultured without addition of delipidators (Control), in the presence of 10μM of Forskolin added to the IVC in D5 (FORSK) or L-carnitine (0.6 mg / mL) added to the IVC and in post-thawing (LC). LC supplementation increased the production of blastocysts in D7 by 22.0% and grade I embryos by 30.1% (P <0.05), in relation to Control and FORSK. In Experiment 1, the re-expansion rate in LC increased (P <0.05) 28.9% in relation to FORSK. In Experiment 2, two Control treatments were used for slow freezing (Classic and Modified). Hatching after 48 hours was greater (P <0.05) in LC compared to FORSK and Classical and Modified Controls (77.5%, 41.9%, 40.5%, 40.8% respectively). In the LC treatment, there was a decrease (P <0.05) of 64.7% in the degenerate embryo rate in relation to the Classical Control. Treatment with delipidators reduced LI content (P <0.001) by 2.2 fold in FORSK and four times in the LC compared to Control. The addition of 0.6 mg / mL of L-carnitine to the culture medium and the post-thawing increased the rate of in vitro production of bovine embryos acting positively on mitochondrial potential, reducing the amount of intracellular lipids and cellular apoptosis and increasing cryotolerance of embryos submitted to the modified slow freezing protocol. / A delipidação química tem sido utilizada como alternativa para a melhoria da criotolerância em embriões produzidos in vitro (PIV). Este estudo foi realizado objetivando avaliar o efeito da Lcarnitina (LC) sobre o desenvolvimento e a sobrevivência de embriões bovinos PIV vitrificados pelo método Cryotop no primeiro ensaio, e no segundo ensaio o efeito comparado da LC e Forskolin em embriões criopreservados por Cryotop (Experimento 1), ou por congelamento lento modificado (Experimento 2). Para isto foram avaliadas a atividade mitocondrial, o conteúdo de lipídeos intracitoplasmático (LI), a apoptose celular e a eclosão após o aquecimento. No primeiro ensaio a LC foi utilizada na concentração de 0,6 mg/mL no meio para maturação (MIV), cultivo (CIV) e/ou recultivo embrionário (REC), em quatro tratamentos: sem LC (Controle), LC adicionado ao CIV (LCiv), LC ao CIV+LC ao REC (LCivR), e LC ao MIV/CIV+ LC ao REC (LMivCR). A adição de LC aumentou (P <0,05) a produção de blastocistos em D7 em 28,6% (LCiv), a quantidade de embriões grau I em 36,9% (LCivR), a taxa de re-expansão em 22,7%, a eclosão em 20,1% (LCiv) e a atividade mitocondrial foi 1,9 vezes maior (P <0,001) (LCivR) em relação ao Controle. A quantidade LI foi 29% menor em LCiv e LCivR e 50,2% em LMivCR comparado Controle (P <0,001). No segundo ensaio os embriões foram cultivados sem adição de delipidadores (Controle), na presença de 10µM de Forskolin adicionado ao CIV no D5 (FORSK) ou L-carnitina (0,6 mg/mL) adicionada ao CIV e ao recultivo (LC). A suplementação com LC aumentou a produção de blastocistos em D7 em 22,0% e de embriões grau I em 30,1% (P <0,05), em relação ao Controle e ao FORSK. No Experimento 1 a taxa de re-expansão no LC aumentou (P <0,05) 28,9% em relação ao FORSK. No Experimento 2 foram utilizados dois tratamentos Controle para congelamento lento (Clássico e Modificado). A eclosão após 48 horas foi maior (P < 0,05) no LC em comparação ao FORSK e aos Controles Clássico e Modificado (77,5%, 41,9%, 40,5%, 40,8% respectivamente). No tratamento LC foi observada diminuição (P < 0,05) de 64,7% na taxa de embriões degenerados em relação ao Controle Clássico. O tratamento com delipidadores reduziu o conteúdo de LI (P < 0,001) em 2,2 vezes em FORSK e quatro vezes no LC comparados ao Controle. A adição de 0,6 mg/mL de L-carnitina aos meios de cultivo e recultivo aumentou a taxa de produção in vitro de embriões bovinos atuando positivamente sobre a atividade mitocondrial, reduzindo a quantidade de lipídeos intracelulares e a apoptose e aumentando a criotolerância dos embriões submetidos ao protocolo de congelamento lento modificado.