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Neurodegenerative diseases are a diverse group of progressive diseases that include Alzheimer’s disease (AD) and prion disease. Although these diseases differ in etiology, they share a number of similarities at the molecular level. For instance, microRNA (miRNA), small RNA molecules that post-translationally regulate gene expression, are often differentially regulated during disease. A previous study identified key miRNA that are dysregulated during prion disease in the hippocampus. Of these miRNA, miR-16-5p is of particular interest, as it has also been found to be dysregulated in AD. The objective of this thesis is to characterize the role of miR-16-5p within hippocampal neurons in order to understand its function during neurodegeneration. It is hypothesized that hippocampal miR-16-5p, given its induction in hippocampal neurons during preclinical disease, plays a role in regulating the dendritic remodeling and synaptic pruning that is the earliest pathological feature of neuronal degeneration in prion disease. To address this hypothesis, primary hippocampal neurons were dissected from embryonic day 18 mice and treated with a lentiviral vector at maturity. This vector either encoded miR-16 or miRZIP-16, causing overexpression or knockdown of miR-16, respectively. Immunoprecipitation of the miRNA-16 enriched RISC complex was then performed, and the co-immunoprecipitated target mRNA was subjected to a whole genome microarray. Analysis of microarray data in Ingenuity Pathway Analysis pinpointed 181 genes involved in neuronal morphology and neurological disease targeted by miR-16. In particular, the MAPK/ERK pathway was targeted at TrkB, MEK1 and c-Raf. This is of interest, as we know that this pathway is disrupted in other neurodegenerative diseases and is directly implicated in neuronal morphology. Subsequent morphological analysis revealed that overexpression of miR-16 in neuronal cells decreased neurite length and branching, consistent with the downregulation of components of the MAPK/ERK pathway. In conclusion, miR-16 targets many mRNA transcripts within the hippocampus that are important members of pathways involved in neuronal development and neurodegeneration, including the MAPK/ERK pathway. / February 2017

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases are a group of infectious neurodegenerative diseases that are associated with misfolding of the cellular form of the cellular prion protein (PrPC) into a disease associated conformer (PrPSc). No therapy for prion diseases is available at present. So far, anti-PrPC vaccination is hampered by immunological tolerance of the mammalian immune system to endogenous PrPC. The aim of this thesis was to set up a new vaccination strategy based on virus-like particles (VLP) to induce anti-PrPC antibody responses in PrPC-competent mice. In a first step it was assessed whether VLP have the capacity to induce antibody responses that are protective against conventional pathogens. For this purpose, VLP displaying the vesicular stomatitis virus-gylcoprotein (VLP-VSV) were generated and tested for their immunogenicity. Similarly to live vesicular stomatitis virus (VSV), replication deficient VLP-VSV induced T help-independent VSV neutralizing IgM responses that switched to the IgG subclass in a T help-dependent manner. Furthermore, type I IFN receptor (IFNAR) triggering only marginally affected VLP-VSV induced neutralizing IgM responses, whereas it was critically required to promote the IgG switch. The analysis of conditional knockout mice with a lymphocyte-specific IFNAR deletion revealed that IFNAR triggering of lymphocytes did not play a crucial role, neither upon VLP-VSV nor VSV immunization. Collectively, these data verified the high immunogenicity of VLP. Therefore, in a next step VLP were generated displaying the C-terminal half of PrP (residues 121-231aa) fused to the platelet derived growth factor receptor (PDGFR) transmembrane region (VLP-PrPD111) for anti-PrPC immunization. On the surface of such retroparticles, PrPC was expressed at high levels as determined by electron microscopy. VLP-PrPD111 immunization of Prnp-deficient (Prnp0/0) mice resulted in antibody response specifically binding the cellular form of PrPC. Upon intravenous injection of wild-type mice, high PrPC-specific IgM responses were induced, whereas the T cell-dependent switch from the IgM to the IgG subclass was less pronounced. As a consequence, anti-PrPC titers were rather short-lived. The impaired subclass switch was probably related with host T cell tolerance to endogenous PrPC. Attempts to increase anti-PrPC IgG responses in wild-type mice via administration of VLP-PrPD111 emulsified in various different adjuvants failed. Nevertheless, in single individuals low IgG antibodies were induced after immunization of VLP-PrPD111 emulsified in CFA. To circumvent T cell tolerance in wild-type mice, a multitude of different immunization strategies was tested, including priming and boosting protocols with different types of VLP or VLP expressing PrPC together with foreign T helper epitopes. Overall, those efforts did not improve anti-PrPC IgG responses in wild-type mice. Interestingly, anti-PrPC antibodies induced in Prnp0/0 mice reduced PrPSc levels in prion infected cell cultures, whereas serum of vaccinated wild-type mice did not. To assess the protective capacity of VLP-PrPD111 induced immune responses, vaccinated wild-type mice were infected with scrapie (RML 5.0). Unfortunately, vaccinated mice did not show a significant delay in the onset of scrapie. In a last part of the thesis it was studied whether in the absence of T cell help activated “memory” B cells were able to produce anti-PrPC specific antibodies. To address this question, PrPC-specific memory B cells were sorted from vaccinated Prnp0/0 mice and adoptively transferred into wild-type recipient mice. Upon VLP-PrPD111 challenge, no PrPC-specific IgG titers were induced in the recipients. Nevertheless, several VLP-PrPD111 challenged recipient mice were protected against scrapie infection. In conclusion, VLP were characterized as highly immunogenic vaccines that were used to elucidate various questions concerning adaptive immune response and basic mechanisms of PrPC-specific tolerance vs. immunity. Remarkably, VLP-PrPD111 was able to induce native PrPC-specific antibodies in wild-type mice but major difficulties associated with PrPC-specific tolerance made efficacious scrapie vaccination impossible. New vaccination approaches are being tested to overcome these limitations. / Prionkrankheiten sind tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Der Erreger ist das infektiöse pathologisch gefaltete Prionen Protein PrPSc, welches durch Umfaltung des zellulären ubiquitär exprimierten Prionen Proteins PrPC entsteht. Bis heute existieren keine erfolgreichen Therapiemöglichkeiten für Prionkrankheiten. Aus unterschiedlichen Zellkulturstudien ist jedoch bekannt, dass Antikörper, die gegen das zelluläre PrPC gerichtet sind, eine PrPSc Ausbreitung verhindern können. Weiterhin zeigen Infektionsstudien in Mäusen, in denen passive Immunisierungen mit PrPC-spezifischen Antikörpern vorgenommen wurden, eine Verlängerung der Inkubationszeit bis zum Ausbruch der Erkrankung. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob es möglich ist, durch eine aktive Immunisierung mit Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) anti-PrPC spezifische Antikörperantworten zu induzieren, die gegen Prionkrankheiten Schutz vermitteln können. Dazu wurde zuerst die Immunogenität von VLP bestimmt, um anschließend PrPC exprimierende VLP als Antigene für PrP-Immunisierungen zu entwickeln. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden replikationsdefiziente VLP, die als fremdes Protein das Vesikuläre Stomatitis Virus Glykoprotein auf der Oberfläche exprimieren, hergestellt (VLP-VSV). VLP-VSV immunisierte Mäuse zeigten analog zu VSV infizierten Tieren T-Zell Hilfe unabhängige neutralisierende IgM Antikörperantworten und einen T-Zell Hilfe abhängigen Subklassenwechsel nach IgG. Interessanterweise ist nach VLP-VSV Immunisierung die frühe Induktion von neutralisierenden IgM Antikörpern unabhängig vom Typ I Interferon Rezeptor (IFNAR) Signalweg. Dagegen wird für den Subklassenwechsel nach IgG der IFNAR-Signalweg benötigt. Mäuse mit einer lymphozytenspezifischen IFNAR-Deletion zeigten nach VLP-VSV oder VSV Infektion IgM und IgG Antikörperantworten gegen VSV. Diese Beobachtungen zeigten, dass der Signalweg über den IFNAR auf Lymphozyten keine entscheidende Rolle bei der Induktion von VSV-neutralisierenden IgG Antikörpern spielte. Zusammenfassend ergab sich aus den Daten, dass VLP-VSV Retropartikel starke Immunogene sind, geeignet um schützende Immunantworten gegen ein Modellvirus zu induzieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden PrPC exprimierende VLP hergestellt. Da der C-terminale Teil des Prionenproteins eine wichtige Rolle bei der Umfaltung von PrPC nach PrPSc spielt, wurde die distale Domäne (Aminosäure 121-231) auf der Oberfläche von VLP exprimiert (VLP-PrPD111). Die erfolgreiche Inkorporation von PrP111 auf VLP konnte mittels Elektronenmikroskopie gezeigt werden. Im nächsten Schritt wurden PrP-defiziente (Prnp0/0) Mäuse mit VLP-PrPD111 immunisiert und auf PrPC-spezifischen Antikörperantworten untersucht. Tatsächlich induzierte die Immunisierung mit VLP-PrPD111 starke Antikörperantworten mit hohen IgG Serum-Titern, die spezifisch die native Form des Prionen Proteins erkannten. Nach VLP-PrPD111 Immunisierung von Wildtyp Mäusen wurde eine Induktion von frühen IgM Antikörperantworten beobachtet, der Subklassenwechsel nach IgG erfolgte jedoch nur sehr schwach. Die induzierten IgG Antikörper zeigten eine geringe Affinität zu PrP und waren nicht lange im Serum nachweisbar. Eine mögliche Ursache hierfür ist die PrPC-spezifische T-Zell Toleranz. Die Zugabe von unterschiedlichen Adjuvanzien zu VLP-PrPD111 verbesserte die IgG Antwort nicht. Als Ausnahme konnte in einzelnen Wildtyp Mäusen nach Immunisierung mit VLP-PrPD111 in „complete Freund´s Adjvant“ (CFA) IgG Antikörper detektiert werden, die bis zu 144 Tage nach der Immunisierung im Serum wiederzufinden waren. Zu einem späteren Zeitpunkt waren diese PrPC-spezifischen Antikörper jedoch nicht mehr detektierbar. Um die T-Zell Toleranz zu umgehen, wurden im nächsten Schritt unterschiedliche Retropartikel in verschiedenen Immunisierungsstrategien getestet. Im Einzelnen wurden verschiedene Typen von PrP-exprimierende HIV oder MLV Retropartikel in Primär- und Sekundärimmunisierungen eingesetzt oder VLP hergestellt, die zusätzlich zum Prion-Protein das VSV-G Protein als fremdes T-Helfer Epitop auf der Oberfläche exprimierten. Mit Hilfe dieser Immunisierungsansätze konnten jedoch keine verstärkten IgG Antikörperantworten in Wildtyp Mäusen erzielt werden. In Zellkultur konnten die in Prnp0/0 Mäusen induzierten PrPC-spezifischen Antikörper den PrPSc-Gehalt in Prion-infizierten Zellen reduzieren. Die Seren der VLP-PrPD111 immunisierten Wildtyp Mäuse zeigten jedoch keinen Schutzeffekt. Im Weiteren wurde getestet, ob VLP-PrPD111 immunisierte Wildtyp Mäuse nach Inokulation eines Maus-adaptierten Scrapiestammes (RML 5.0) geschützt sind. Die VLP-PrPD111 immunisierten Mäuse erkrankten jedoch im gleichen Zeitraum wie nicht immunisierte Kontrolltiere. Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob nach adoptivem Transfer von Prnp0/0 B-Gedächtniszellen in Wildtyp Rezipienten eine Steigerung der PrPC-spezifischen Immunantwort in Abwesenheit von T-Zellhilfe erzielt werden kann. Dazu wurden aus VLP-PrPD111 immunisierten Prnp0/0 Mäusen B-Zellen isoliert und adoptiv in Wildtyp Rezipienten transferiert. Nach VLP-PrPD111-Immunisierung der Wildtyp Rezipienten konnten keine erhöhten IgG Antikörper Titer beobachtet werden. Trotzdem waren einzelne Wildtyp Mäuse nach PrPSc Inokulation gegen Scrapie geschützt. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass VLP-PrPD111 sehr gute Antigene sind, die durchaus eine Umgehung der PrP-spezifischen Toleranz erlauben. Im Vergleich zu anderen bisher beschriebenen PrP-spezifischen Antikörperantworten, die nach Immunisierung vorzugsweise lineare Epitope erkennen, induzierten VLP-PrPD111 Autoantikörperantworten, die gegen das native PrPC Protein gerichtet sind. Schwierigkeiten bezüglich aktiver PrP-Immunisierungen liegen jedoch in der verbleibenden T-Zell Toleranz gegenüber PrPC.

Übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod führen. Die protein only-Hypothese besagt, dass das infektiöse Agens „Prion“ teilweise oder vollständig aus dem zellulären Prion-Protein (PrPC) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrPC in die pathogene Isoform (PrPSc) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrPC sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine mögliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Homöostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-Linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrPC etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-PrP) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrPΔ32-134 (tr-PrP), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Domäne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20% erhöhte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-PrP in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Veränderungen führte, wurde die Lebensspanne um 8% reduziert. Ko-Expression von wt-PrP und tr-PrP konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizität der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion übergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabhängigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-PrP eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-PrP-exprimierende Tiere eine normale Anfälligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-PrP der Toxizität der Deletionsmutante übergeordnet zu sein. Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bezüglich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Domäne, durch die möglicherweise Fenton-ähnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff-Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden könnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-PrP und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung über einen bislang unaufgeklärten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die Möglichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner ermöglicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzuklären. / Transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal progressive neurodegenerative disorders. The protein only hypothesis proposes that the infectious agent designated prion consists partly or entirely of the host cellular prion protein (PrPC) and, when the prion is introduced into the organism, causes the conversion of PrPC into the pathogenic isoform PrPSc. However, the disease underlying neuropathogenic mechanisms and the physiological function of PrPC still remain unknown, although a neuroprotective function or a role in oxidative stress homeostasis has been postulated previously. In this work transgenic Drosophila melanogaster lines were evaluated as a model for studying the function of PrPC. By using the bipartite expression system UAS/GAL4 either wild-type PrP (wt-PrP) or a truncated disease associated variant PrPΔ32-134 (tr-PrP) lacking the putative neuroprotective octarepeat domain were utilized. Wt-PrP transgenic flies displayed an approximately 20% increase in average lifespan compared to controls. Although expression of tr-PrP in Drosophila did not induce any obvious neuropathology, it significantly reduced the lifespan by 8%. Co-expression of wt-PrP and tr-PrP did not complement this phenotype, indicating a chronic toxicity of the truncated PrP that is overriding the neuroprotection. Since extended lifespan and stress resistance are closely associated, flies were exposed to the reactive oxygen species (ROS) hydrogen peroxide, oxygen and Paraquat as three independent treatments to provoke oxidative stress. Interestingly, wt-PrP confered resistance to ROS-induced stress, whereas tr-PrP transgenic flies showed normal susceptibility, which was partly rescued by co-expression of wt-PrP. In this regard PrP presence in its physiological compartment, the central nervous system, is sufficient to maintain the described beneficial effects. These findings suggest that PrP is involved in oxidative stress homeostasis by a mechanism that requires the copper binding octarepeat domain. This function might be responsible for the inhibition of Fenton-like reactions which are known to play an important role in oxygen radical synthesis. Consistent with this theory is the observation that ectopic expression of the octarepeat deletion mutant tr-PrP reduces both acquired stress resistance and lifespan by an unrelated, yet unknown mechanism. The Drosophila PrP model provides the possibility to investigate the physiological function of PrP in more detail. It is likewise considerable to identify unknown ligands of PrP in order to uncover PrP signal transduction pathways or neuropathogenic mechanisms.

Das Prion-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Entwicklung einer Therapie für Prionenerkrankungen eine Induktion von Autoantikörpern gegen das Prion-Protein voraussetzt. In dieser Arbeit wurden aktive Immunisierungsstrategien gegen das zelluläre Prion-Protein beschrieben und die zellulären und humoralen Immunantworten sowie deren Einfluss auf die Entstehung einer Prionenerkrankung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Immunisierung mit rek. mPrP und Adjuvants eine Aktivierung und Proliferation von PrP-spezifischen T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen induziert wurde. Desweiteren konnten in PrP-defizienten Mäusen spezifische Antikörper gegen das Prion-Protein nachgewiesen werden, die in der Lage waren, die pathogene Form des PrPs (PrPSc) zu detektieren und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die Immunisierung mit rek. mPrP und CpG-1826 konnten in CD4+-T-Zellen erhöhte Zytokinspiegel von TNF und IFN induziert werden. Im Gegensatz dazu konnte keine T-Zell-Antwort und nur geringe Antikörperkonzentrationen nach Proteinimmunisierung in Wildtypmäusen nachgewiesen werden. Die induzierten Antikörper in Wildtypmäusen waren nicht in der Lage den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. In einem zweiten Ansatz wurde die Immunisierung mit zwei unterschiedlichen PrP-exprimierenden DNA-Vektoren durchgeführt. Hierfür wurden der pCG-PrP-Vektor, der das Maus-PrP exprimiert, und der pCG-PrP-P30-Vektor, der zusätzlich zum PrP für das P30-Th-Epitop des Tetanustoxins kodiert, verwendet. Dieses P30-Epitop wurde schon in früheren Arbeiten genutzt, um die Toleranz gegen körpereigene Proteine zu brechen. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die DNA-Immunisierung eine PrP-spezifische Antikörperantwort in Prnp0/0-Mäusen induziert werden konnte. In Wildtypmäusen wurden allerdings nur geringe Antikörpertiter nachgewiesen. Die Antikörper aus den Prnp0/0-Mäusen waren in der Lage PrPSc zu erkennen, und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die DNA-Immunisierung wurde eine PrP-spezifische Aktivierung und Proliferation von T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen erreicht, die nach Immunisierung mit pCG-PrP-P30 stärker war als nach Immunisierung mit pCG-PrP. Nach DNA-Vakzinierung konnte in Wildtypmäusen eine unspezifische Erhöhung der Zytokinantwort mit erhöhten TNF- und IFN-Spiegeln nachgewiesen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Kombination aus DNA- und Proteinimmunisierung durchgeführt, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die nach DNA-Immunisierung allein erreicht wurden. Die Inokulation der immunisierten Wildtypmäuse mit einem Maus-adaptierten Scrapiestamm (RML) zeigte keinen Schutz dieser Tiere vor einer Prionenerkrankung. Alle Mäuse aus der immunisierten und nicht immunisierten Gruppe erkrankten im gleichen Zeitraum an Scrapie, zeigten PrPSc Akkumulation im Gehirn und in der Milz und für Prionenerkrankungen typische histopathologische Veränderungen. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Immunisierungsstrategien entwickelt werden, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen und einen Schutz vor Prionenerkrankungen zu induzieren. / The prion protein (PrPC) plays a pivotal role in transmissible spongiform encephalopathies (TSE). Recent studies have shown that strategies aimed to elicit antibodies against PrP should be considered as a promising therapeutic approach for prion diseases. In this study active immunisation strategies against PrPC were described, humoral and cellular immune responses as well as the influence of the onset of the prion disease were analyzed. Here we demonstrate that immunisation with recombinant murine prion-protein (mPrP) results in activation and proliferation of PrP-specific T cells and induction of PrP-specific antibodies in PrP-deficient mice (Prnp0/0). These antibodies are able to detect and reduce PrPSc levels in cell culture. Immunisation with rek. mPrP and CpG-1826 results in increased levels of TNF and IFNin Prnp0/0 mice. In contrast no T cell response and only low antibody titers against PrP were found in individual wild-type mice. The low level of antibodies in wildtype mice were not able to reduce the PrPSc level in cell culture. In a second approach, we investigated a new immunisation strategy against PrPC with two vaccine DNA vectors (pCG-PrP and pCG-PrP-P30). The pCG-PrP vector system contains murine PrP sequence, whereas the pCG-PrP-P30 vector also contains an immune stimulatory peptide of the tetanus toxin, which has been shown to break tolerance against self proteins. Results indicate that this improved vaccine evokes a sustained antibody response in Prnp0/0 mice, but only low antibody titers were found in wild-type mice. The antibodies from Prnp0/0 mice were able to detect PrPSc and to reduce PrPSc levels in cell culture. DNA immunisation induced activation and proliferation of PrP-specific T cells in Prnp0/0-mice which was even stronger after immunisation with pCG-PrP-P30 than after pCG-PrP treatment. DNA vaccination induced an unspecific T cell response with increased levels of IFN and TNF in wild-type mice. Furthermore we combined DNA and protein immunisation to break tolerance against PrP. The results obtained were similar then those after DNA vaccination alone. Inoculation of the immunised wildtype mice with mouse adapted scrapie prions showed that these animals were not protected against the development of the prion disease. All mice in the vaccinated and control groups succumbed to scrapie with similar incubation times, deposition of PrPSc in brain and spleen and typical histopathological changes in the brain. Nevertheless based on these findings additional strategies of immunisiation should be envisaged to develop immunotherapeutic approaches to break tolerance against PrP and to protect against the prion disease.

Prion diseases are fatal infectious neurodegenerative disorders hypothesised to be caused by misfolding of the prion protein. Following prion infection, the infectious agent is sequestered to and replicates upon follicular dendritic cells (FDC) within lymphoid follicles prior to neuroinvasion. The mechanism of transport of the prion infectious agent from the site of infection to FDC is unknown. One of the postulated routes of transport is the specific migration of antigen presenting cells (APC) to FDC. APC specifically capture antigenic material and transport and present that material to effector cells and FDC in order to generate an appropriate acquired immune response. FDC reside within the B-cell follicle of secondary lymphoid organs. FDC organise and maintain the B-cell follicular structure by secretion of the chemokine CXCL13 which stimulates chemotactic movement of cells which express the CXCR5 receptor, e.g. B cells. Dendritic cells are specialised APC that are commonly characterised by their expression of CD11c. Transport of the prion infectious agent from the site of infection to FDC was observed to be blocked or severely delayed following depletion of CD11c+ cells. To determine whether CD11c+ cells acquire prions and subsequently deliver them to the FDC, the chemokine receptor CXCR5 was depleted from CD11c+ cells using a conditional transgenic mouse model. These mice were characterised for normal lymphoid organogenesis and monitored for their responses to oral infection with either prions or intestinal helminths. Data in this thesis show that the CD11c-mediated depletion of CXCR5 resulted in a delay in peripheral prion pathogenesis after oral exposure and significantly reduced disease susceptibility. These data suggest that efficient prion transport to FDC requires delivery by APC and is potentially mediated by CXCR5 chemotaxis. Following oral exposure to the intestinal helminth (Trichuris muris) CD11c-mediated depletion of CXCR5 prevented the establishment of a protective TH2 response. As a consequence the mice mounted a TH1-dominated response and were unable to clear the infection. These data also confirm that the effective generation of TH2 responses to oral helminth infection also requires APC localisation to B-cell follicles via CXCR5.

Prion diseases are a group of fatal neurodegenerative diseases, including CJD and scrapie, which are thought to be caused by a protein termed a prion (PrP). As manganese has previously been suggested to be involved in prion disease we have investigated manganese binding to PrP and its role in the toxicity of the protein. We have shown that manganese bound PrP (MnPrP) has several of the characteristics of the disease form of PrP, including protease resistance and toxicity that is dependent on cellular PrP expression. Further investigation into the mechanism of toxicity revealed that MnPrP is significantly more toxic to neuronal cells than nonmanganese bound PrP and that toxicity requires the presence of known metal binding residues within the protein. We have demonstrated that treatment of neuronal cells with MnPrP causes caspase 3 activation and apoptosis, as demonstrated by DNA laddering, and we hypothesise that caspase 3 is activated by a p38 pathway. Treatment of neurones with MnPrP also caused a significant increase in cellular ROS production, although this did not appear to be a major cause of cell death as antioxidants were unable to save cells from cell death. We also investigated mechanisms by which cells can survive scrapie infection and MnPrP toxicity. We have shown that cells infected with scrapie have increased ERK activation which was important for their survival. Cells that survived MnPrP treatment were also found to have increased ERK activation. This suggests that ERK may have a protective role in prion diseases and may be a potential therapeutic target.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a powerful approach to study the structure and dynamics of macromolecules in a close-to-native solution environment. In the present thesis I present my investigation of protein and nucleic acid structure and dynamics in a wide variety of biological systems using NMR spectroscopy. The center of attention of the Sykes laboratory for the last 35 years has been the role of the Troponin complex in the regulation of muscle contraction. Accordingly, the main focus of this thesis is the study of this important nano-machine, and how its structure and dynamics regulate its biological function. In Chapter II, the perturbation of Troponin C’s structure and dynamics by the attachment of two different bifunctional rhodamine probes is investigated. In Chapter III, the dynamics and position of the bifunctional rhodamine probe when attached on the C helix of Troponin C is studied. In Chapter IV, the structure and dynamics of tryptophan mutants of Troponin C is reported. In Chapter V, the effect of the co-solvent trifluoroethanol on the tryptophan side chain position of mutant F77W of the N-domain of Troponin C is examined. In the following chapter, Chapter VI, the structure and dynamics of a Troponin C – Troponin I chimera is studied using NMR spectroscopy and molecular dynamics simulations to assess the presence or absence of an intrinsically disordered region in Troponin I, and to assess the validity of the flycasting mechanism proposed to regulate muscle contraction. In Chapter VII and VIII, a different topic is introduced. The structural changes occurring during the denaturation process of the bovine prion protein are monitored using NMR spectroscopy to gain insights into the protein misfolding process that causes diseases. In Chapter IX, the structural impact of inserting nucleoside phosphonates into DNA are examined by reporting the NMR structure of a DNA dodecamer duplex containing the modified nucleoside Cidofovir at position 7.

La formació de fibres amiloides és un tret característic dels sistemes nerviosos afectats per malalties com la d'Alzheimer o les priòniques. En els teixits, les fibres es troben associades a les membranes cel·lulars i a elements de la matriu extracel·lular com els glicosaminoglicans. En les diferents malalties amiloidogèniques, pèptids i proteïnes amb una homologia seqüencial molt baixa, donen lloc a la formació d'agregats amiloides, de característiques físico-químiques molt semblants. Aquest fet implica la possibilitat que existeixi un mecanisme comú de formació d'agregats amiloides i, per tant, una possible via d'intervenció comuna a les diferents malalties. En aquest sentit, ha estat descrit recentment un hipotètic motiu estructural d'unió a esfingolípid que seria comú al fragment 1-28 del pèptid β amiloide, relacionat amb la malaltia d'Alzheimer, i el fragment 185-208 de la proteïna priònica humana. A més, les dues seqüències contenen residus d'His, involucrats en possibles motius d'unió a heparina. El fragment 1-28 del pèptid β amiloide ha estat molt estudiat pel que fa a la seva capacitat per formar fibres amiloides, a la influència de l'heparina en el procés d'agregació i, fins i tot, en la seva capacitat d'interacció amb membranes biològiques. Les propietats amiloidogèniques del fragment 185-208 de la proteïna priònica, en canvi, eren fins ara desconegudes. Combinant l'espectroscòpia d'IR i de fluorescència amb la microscòpia electrònica, hem procedit a la determinació de les característiques amiloidogèniques del fragment priònic. Els resultats mostren que aquest fragment és capaç de formar fibres amiloides, seguint el característic procés de polimerització nucleada, només en presència d'heparina i de membranes biològiques amb càrrega superficial negativa. Les fibres formades mostren la típica morfologia amiloide. A diferència del fragment 1-28 del pèptid de l'Alzheimer, el fragment priònic és citotòxic, reduint en un 25% la viabilitat cel·lular en una línia de neuroblastoma. Un cop caracteritzat el fragment priònic, s'han estudiat les capacitats anti-amiloidogèniques dels dendrímers, uns polímers ramificats amb càrrega superficial positiva capaços d'interferir en el procés d'agregació amiloide, modulant la formació de fibres. / La formación de fibras amiloides es una característica fundamental de los sistemas nerviosos afectados por la Enfermedad de Alzheimer o las enfermedades priónicas. En estos tejidos, las fibras están asociadas a las membranas celulares y a glicosaminoglicanos. En las diferentes enfermedades amiloidogénicas, péptidos y proteínas con homología secuencial muy baja dan lugar a la formación de agregados amiloides, los cuales tienen características fisicoquímicas muy similares. Este hecho implica la posibilidad de que exista un mecanismo común de formación de este tipo de agregados y, por tanto, una posible via de intervención común a las diferentes patologías. En este sentido, se ha descrito recientemente un hipotético motivo estructural de unión a esfingolípidos que seria común al fragmento 1-28 del péptido β amiloide, relacionado con la enfermedad de Alzheimer, y el fragmento 185-208 de la proteína priónica humana. Además, las dos secuencias contienen residuos de His, involucrados en posibles motivos de unión a heparina. El fragmento 1-28 del péptido β amiloide ha sido ampliamente estudiado en lo que se refiere a su capacidad de formar fibras amiloides, la influencia de la heparina en su proceso de agregación e, incluso, en su capacidad de interacción con las membranas biológicas. Las propiedades amiloidogénicas del fragmento 185-208 de la proteína priónica humana, en cambio, actualmente eran desconocidas. La combinación de la espectroscopia de IR y de fluorescencia con la microscopia electrónica, nos ha permitido determinar las características amiloidogénicas del fragmento priónico. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que este fragmento es capaz de formar fibras amiloides, siguiendo el característico proceso de polimerización nucleada, sólo en presencia de heparina y de membranas biológicas con carga superficial negativa. Las fibras formadas muestran la típica morfología amiloide. A diferencia del fragmento 1-28 del péptido del Alzheimer, el fragmento priónico resulta citotóxico, reduciendo en un 25% la viabilidad celular en una línea celular de neuroblastoma. Una vez caracterizado el fragmento priónico, se han estudiado las propiedades anti-amiloidogénicas de los dendrímeros, unos polímeros ramificados y con carga superficial positiva capaces de interferir en el proceso de agregación amiloide, modulando la formación de fibras. / Amyloid fibril formation is a hallmark of nervous systems affected by Alzheimer's and prion diseases. In both pathologies, fibrils are found associated to cellular membranes and glycosaminoglycans. In this kind of pathologies, amyloid peptides and proteins with very poor sequence homology originate very similar aggregates. This fact implies the possible existence of a common amyloid formation mechanism, and therefore, common pathogenic mechanisms. In this sense, a homologous structural sphingolipid-binding motif has been described for the Alzheimer's peptide Aβ(1-28) and the human prion protein fragment PrP(185-208). Both sequences contain His residues in a cluster of basic residues proposed as a heparin binding motif.The Aβ(1-28) fragment has been widely described as an amyloid peptide and the influence of heparin in its aggregation process and its interaction with cellular membranes have been studied. The amyloidogenic properties of prion fragment were still unknown. In the present work, we have used a combination of spectroscopic techniques (Fourier-Transform Infrared Spectroscoy and Fluorescence Spectroscopy) complemented with electron microscopy in order to characterize PrP(185-208) as an amyloid peptide.The results show that PrP(185-208) is able to form amyloid aggregates following a nucleation-dependent polymerization only in the presence of heparin or negatively charged model membranes. The formed fibers show the typical amyloid morphology. Whereas Aβ(1-28) fragment is not toxic, as already known, 25% of the viability cell population in a neuronal cell line is reduced in the presence of PrP(185-208). Once the prion peptide was characterized as an amyloid, we checked the possible anti-amyloid properties of dendrimers, branched and globular polymers with a densely positive surface. Dendrimers ability to interfere with the aggregation process, modulating fibril formation is shown.