Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-10-03T12:47:48Z No. of bitstreams: 1 TesePLSB.pdf: 13905738 bytes, checksum: 1789e96e4fee04313be2237c09868fd3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T19:44:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TesePLSB.pdf: 13905738 bytes, checksum: 1789e96e4fee04313be2237c09868fd3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T19:44:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TesePLSB.pdf: 13905738 bytes, checksum: 1789e96e4fee04313be2237c09868fd3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T19:45:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TesePLSB.pdf: 13905738 bytes, checksum: 1789e96e4fee04313be2237c09868fd3 (MD5) Previous issue date: 2015-08-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Mulberry leaves are commonly used by women to alleviate hot flashes, shivering and night sweats. These symptoms appear due to the irregular estrogen secretion by ovaries during climacteric and are often alleviated using natural products for non-hormonal replacement therapy (NHRT). A recurrent issue regarding the use of plant extracts as therapeutics is the lack of standardization, compromising their efficacy. In the present work, hydroethanolic extracts of Morus alba leaves with pharmaceutical potential were qualitatively and quantitatively standardized. All extracts were screened by in vitro assays for estrogenicity based in estrogen receptor cell model (ER+ MFC-7). The ones containing up to 35% ethanol (v/v) induced cell proliferation like 17--estradiol. The extracts with alcohol level between 35 and 75% behaved as partial agonists, while higher alcohol content extracts killed the cells. In ER selectivity in vitro assay based on ER- cell model (MDA-MB-231), extracts prepared with up 55% ethanol were inactive and the others killed them. Cell-based assays using non-tumoral fibroblasts showed cytotoxicity for extracts with ethanol concentration higher than 60%. Thus, extracts prepared using 0-35% ethanol were the more suitable for phytoestrogenic sources in NHRT. Ethanol solutions (50-60%) were the best ones to get an extract with antitumoral potential for triple negative breast cancer subtype. Multivariate exploratory techniques were applied to analyze the chemical profile provided by FT-ICR-MS and LC-DAD-MS. Extracts with estrogenic activity had 3-O-(6”-glycosyl), 3-O-(6”- rutinosyl) e 3-O-(6”-malonylglycosyl) derivatives of quercetin and kaempferol. These 6 coumpounds were then defined as chemical markers for the quantitative standardization of mulberry leaf extracts, expressed as total flavonoids content (TFC). The maximum TFC was below 3% (w/w) in the total agonistic-like extracts. In the partial agonist-like and highly toxic ones the average levels were 4.8% and 4,4% respectively. The influence of environmental factors over the bioactive compounds content in mulberry leaves was also investigated. Four-seasons: the highest TFC was found in the beginning of spring (4.9%) and the lowest one in autumn (2.0%). Circardian cycle: the maximum TFC was reached in early morning (2.4%), gradually reducing throughout the photoperiod. Senescence: TFC average increment at 0.53% monthly. Hydric stress: higher TCF values (2.0%) were found during drought periods. Quantitative analysis of the chemical markers was also performed in samples of mulberry-based herbal drugs. The TCF results showed a huge variability among them (0.28 to 13.88%), clearly evidencing the lack of standardization of raw materials to be used in formulations. This work highlighted that mulberry leaf hydroethanolic extracts are sources for phytoestrogens and hence have promising potential for treatment of climacteric symptoms, but the control of extraction solvent composition is the key to efficacy. Small changes on it can interfere substantially in the expected biological activity, hence the concentration of bioactive compounds must be kept under an optimal range, even in an unfavorable environmental condition. / As folhas de amoreira são popularmente utilizadas por mulheres no alívio das ondas de calor e sudoreses noturnas, sintomas decorrentes da produção irregular de estrogênio no climatério. Um problema recorrente no uso comum de produtos naturais com fins medicinais é o comprometimento da eficácia, pois não há controle de qualidade dos produtos. Neste trabalho foi realizada a padronização química qualitativa e quantitativa de extratos hidroetanólicos de folhas de Morus alba com potencial para uso no tratamento desses sintomas. Em testes in vitro de estrogenicidade com células ER+ (MCF-7) extratos com até 35% (v/v) de etanol:água estimularam o crescimento celular como o 17--estradiol. Aqueles contendo entre 35 e 75% de álcool atuaram como agonistas parciais, enquanto extratos com elevado teor alcoólico induziram a morte celular. Nos estudos de seletividade para o receptor estrógeno com células ER- (MDA-MB-231), extratos preparados com até 55% etanol foram inativos, enquanto os demais levaram à morte das células. Estudos com células de fibroblastos não tumorais (BALB/c 3T3 clone 31) mostraram citotoxicidade para extratos com percentual alcoólico superior a 60%. Assim, extratos preparados com 0-35% etanol foram os mais indicados para uso como fonte de fitoestrógenos em NHRT e aqueles com 50 - 60% foram indicados como antitumorais em câncer de mama triplo-negativo. Ferramentas quimiométricas multivariadas aplicadas na análise do perfil químico dos extratos por FT-ICR-MS e LC-DAD-MS associaram a atividade estrogênica aos derivados 3-O-(6”-glicosil), 3-O-(6”- rutinosil) e 3-O-(6”- malonilglicosil) dos flavonoides quercetina e campferol, os quais foram selecionados como marcadores químicos para a padronização quantitativa do extrato em teor de flavonoides totais. Nos extratos com perfil de agonismo total, o teor máximo encontrado foi inferior a 3% (m/m), enquanto naqueles com agonismo parcial e com elevada citotoxicidade, os teores médios foram respectivamente 4,8% e 4,4%. A influência de fatores ambientais no teor dos compostos bioativos em folhas de amoreira também foi avaliada. Estações do ano: o maior teor foi encontrado no início da primavera (4,9%) e o menor no início do outono (2,0%). Ciclo circadiano: o valor máximo foi obtido no início da manhã (2,38%), com redução gradual ao longo do fotoperíodo. Senescência: crescimento no teor total dos flavonoides a uma taxa mensal média de 0,53%. Estresse hídrico: valores mais altos (2,0%) foram obtidos em períodos de estiagem. Análises quantitativas dos marcadores também foram realizadas em amostras de medicamentos fitoterápicos comerciais de amora, mostrando grande variabilidade nos teores (0,28 a 13,88%), evidenciando a falta de padronização dos extratos nas formulações. Esse trabalho mostrou que extratos hidroetanólicos de folhas de Morus alba possuem fitoestrógenos e têm potencial aplicação em medicamentos fitoterápicos. Além disso, o controle da composição do solvente extrator é fundamental para garantir a eficácia do extrato, visto que pequenas alterações podem tanto alterar significativamente a atividade biológica esperada, como manter a concentração dos compostos bioativos em uma faixa ótima, mesmo quando a sua produção é desfavorecida por fatores ambientais. / FAPESP 2011/24137-0 / CNPq 146902/2011-4