En faisant le parallèle avec les selles modernes, les coprolithes peuvent être appropriés à l'étude des habitudes alimentaires, de la flore intestinale et des maladies, des animaux et des hommes ayant vécu il y a des siècles. Dans le travail de thèse ici présenté, un coprolithe datant des 14-15ième siècles, provenant de Namur en Belgique, a été étudié. Dans un premier temps l'ensemble de la communauté microbienne associée au coprolithe été characteriser. Les résultats ont montré qu'une partie du microbiote est similaire à l'environnement et l’autre la flore intestinale, des parasites intestinaux et des pathogènes systémiques ont été aussi trouvés. Un second projet a visé à la purification de particules virales à partir du coprolithe et leur analyse par microscopie électronique et métagénomique virale. Des particules virales sphériques, ainsi que des bactériophages, ont ainsi été observés. Les virus associés au coprolithe correspondent à des virus d'eucaryotes, de procaryotes et d'archaea. La communauté virale était dominée par des bactériophages détectés dans le sol et les selles. Parmi les fonctions métaboliques détectées, une correspond d'ailleurs à des résistances aux antibiotiques. Dans un troisième projet, des cultures et des identifications moléculaires ont été réalisées sur des kystes d'amibes observés dans le coprolithe. Les amibes isolées appartiennent au genre Acanthamoeba et pourraient avoir été conservées sous forme de kystes pendant des siècles dans le coprolithe. Les co-cultures d'amibes ont mené à l'isolement d'une nouvelle bactérie bi-flagellée résistante aux amibes, proche des Rickettsiales. / By drawing parallels to modern stools, coprolites can be suitable specimen to study diet habits, gut microbiota and diseases of animals and humans that have lived centuries ago. During this thesis work, a 14-15th century coprolite specimen from Namur, Belgium was analyzed. At the initiation of this thesis work, it was aimed to characterize the entire microbial communities associated to the coprolite and to identify ancient pathogens. Results indicated that parts of the microbiota are similar to those coming from environment and the gut microbiota inhabitants. Further intestinal parasites and systemic pathogens – still relevant nowadays – were also found. In a second work, viral particles were purified from the Namur coprolite and analyzed by electron microscopic and viral metagenomic. Viral particles associated to spherical virions and bacteriophages were observable. Viruses infecting eukaryotes, bacteria and archaea were associated to the specimen. The viral community was dominated by bacteriophages commonly found in soil and in modern stools and antibiotic resistance was one of the metabolic functions detected. In a third project, culture and molecular identification were performed on amoebal cysts observed within the coprolite. The amoebas isolated belong to the genus Acanthamoeba and might have been conserved in form of cysts inside the Namur coprolite for centuries. Amoeba-co culturing leaded to the isolation and identification of a new bi-flagellar amoeba-resistant bacterium closely related to Rickettsiales.

Il a été démontré que la pulpe dentaire pouvait constituer un matériel de choix pour la paléomicrobiologie. Au début de ce travail de thèse, nous avons envisagé de rechercher les bactéries bactériémiques chez les mammifères à partir de la pulpe dentaire de dents contemporaines et anciennes. Au préalable, il était nécessaire de classer les dents modernes et anciennes mises à notre disposition par les zoologues et en particulier de déterminer l’espèce à laquelle les dents anciennes appartenaient car il est souvent difficile de différencier morphologiquement des dents appartenant à des espèces proches. Deux méthodes ont été utilisées pour réaliser cette partie de notre travail: la première méthode moléculaire avec comme outil, le gène séquençage du cytochrome b et la seconde protéomique par analyse des profils peptidiques de la pulpe dentaire. Les résultats obtenus ont confirmé que la pulpe dentaire peut constituer une source d’ADN ancien et de protéines anciennes.Dans un deuxième travail, faisant suite aux travaux effectués dans le laboratoire, en collaboration avec différentes équipes d’anthropologues, nous avons mis en place une technique de détection simultanée à haut débit d’ADN bactérien ancien combinée à une PCR «suicide». Cette technique appliquée à la pulpe dentaire de dents humaines anciennes a été utilisée pour détecter sept pathogènes. Les résultats obtenus par cette technique moléculaire attestent de la présence simultanée d’ADN de Y. pestis et de B. quintana dans la pulpe dentaire de dents prélevées sur des restes humains dans les sépultures de Bondy, France (XIème - XVème) et de Venise, Italie (XIVème - XVIème). Ces données suggèrent la transmission de Y. pestis par le pou de corps, vecteur connu de B. quintana, au cours des épidémies de peste ancienne. Les résultats obtenus ont confirmé ceux obtenus par cinq autres équipes que Y. pestis est l'agent responsable de la «Peste Noire». Les résultats de notre travail de Thèse contribuent à la paléomicrobiologie. / The dental pulp has been demonstrated to be a suitable specimen on which to base paleomicrobiology studies. At the initiation of this Thesis work, we aimed to detect bacteria in the dental pulp extracted from contemporary and ancient mammals’ teeth. In mammals, the first task was the classification of species to which the teeth belong. In a first work, we have accomplished this task by two methods used in parallel: the molecular method based on cytochrome b gene sequencing and proteomic method by the dental pulp MALDI TOF mass spectrometry peptide profiling. The results of this work demonstrated that dental pulp is a source for studying both ancient DNA and ancient proteins. In a second work, following previous publications, we detected bacterial DNA from dental pulp of ancient human teeth using a multiplex high-throughput “suicide” PCR to detect seven pathogens (Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Borrelia recurrentis, Bartonella quintana, Rickettsia prowazekii, Salmonella enterica Typhi and Poxvirus). We demonstrated the simultaneous presence of Y. pestis DNA and B. quintana DNA in dental pulp specimens collected from burials in Bondy, France dating 11th-15th and burials in Venice, Italy dating 14th-16th. This result may suggest the transmission of Y. pestis by the body louse, the known vector of B. quintana. Also, these results reinforce the large corpus of data produced by five different teams (Pusch et al., 2004 ; Cerutti et al., 2007 ; Bianucci et al., 2009 ; Haensch et al. 2010 ; Wiechmann et al. 2010) that the agent of the Black Death is Y. pestis. Our results herein contributed to the works in paleomicrobiology.

La revue de la littérature montre que la pulpe dentaire est une source utile pour le diagnostic des bactériémies, y compris en paléomicrobiologie. Les précédents travaux en paléomicrobiologie réalisés dans le laboratoire ont tous mis en évidence une amplification possible de courts ou très courts fragments d'ADN bactérien partant de l'hypothèse que l'ADN ancien est fragmenté. Dans le premier travail, le modèle expérimental de dégradation de l'ADN des macrophages murins J774 et de Mycobacterium smegmatis par la chaleur sèche à 90°C a montré une différence statistiquement significative (p < 0.05) entre la vitesse de fragmentation de l'ADN bactérien et eucaryote. Ces résultats suggèrent que les diagnostics paléomicrobiologiques peuvent détecter des fragments plus longs d'ADN bactérien à partir des échantillons anciens. Dans un deuxième travail, un système de détection rapide de 7 agents pathogènes par PCR multiplex en temps réel a été utilisé pour détecter ces pathogènes suspectés à partir de la pulpe dentaire de 1192 dents anciennes collectées dans 12 charniers dont un localisé à Douai (1710 – 1712). Après la détection de Bartonella quintana dans ce charnier, les PCRs en temps réel emboîtées ultra-sensibles et la «PCR suicide» ont été utilisées pour confirmer la présence de Rickettsia prowazekii souche Madrid E génotype B dans 6/55 pulpes dentaires (11%) collectées de 6/21 squelettes (28.6%) de soldats à Douai. Ces résultats supportent l'hypothèse que le typhus a été introduit en Europe par les soldats espagnols au retour des conquêtes en Amérique. / Reviewing the literature shows that dental pulp is a useful source for bacteremic and paleomicrobiological diagnoses. In the first work, an experimental model of DNA degradation of the murine macrophage cell line J774 and Mycobacterium smegmatis by exposure to 90°C dry heat showed a statistically significant difference (p < 0.05) of fragmentation level between bacterial and eukaryotic DNA. These results suggest that paleomicrobiological diagnosis can detect more large fragments of bacterial DNA from ancient buried specimens. In the second work, a system of rapid detection of seven pathogens by multiplex real-time PCR was used for detecting suspected pathogens from dental pulp of 1192 ancient teeth collected from 12 multiple burials including a mass grave in Douai, 1710 – 1712. After the Bartonella quintana detection in this site, real-time nested PCR and ultra-sensitive “suicide PCR” were used to confirm the presence of Rickettsia prowazekii strain Madrid E genotype B in 6/55 dental pulp specimens collected from 6/21 (29%) skeletons of soldiers buried in Douai.These results support the hypothesis that typhus was imported into Europe by Spanish soldiers from America. In the last work, DNA extracted from 5 dental pulp specimens collected from multiple burials at Issoudun, 17th – 18th centuries, was analyzed by pyrosequencing which detected Yersinia pestis sequences in the metagenome. For paleomicrobiology, pyrosequencing is a sensitive technic which can be used as baseline test to detect both suspected and unexpected pathogens from ancient specimens. We named this new approach «paleometagenomics».

Les Anelloviridae sont de petits virus à ADN simple brin de découverte récente, très largement répandus chez les vertébrés. Chez l'homme, 3 genres distincts ont été caractérisés : Alphatorquevirus (TTV), Betatorquevirus (TTMV), Gammatorquevirus (TTMDV), engendrant une infection chronique mais dont le pouvoir pathogène potentiel demeure encore méconnu. Leur épidémiologie est en constante réévaluation du fait de leur extrême variabilité et diversité génétique. Au cours de cette recherche à l'interface entre virologie et paléomicrobiologie, nous avons exploré l'histoire naturelle de ces virus via 2 axes interconnectés. D'une part la diversité génétique a été analysée lors d'une étude transversale au sein de populations contemporaines (française et afghane) et de populations anciennes datant du néolithique à l'époque moderne. D'autre part, leur évolution a été étudiée à l'échelle individuelle par une étude longitudinale au sein de 2 corpus (suivis de patient transplanté et de patient hémodialysé). Dans le but de compléter les données concernant cette famille virale unique, un travail méthodologique a été mis en oeuvre afin d'apporter des améliorations et de standardiser les protocoles d'analyse existants. La comparaison de distribution des Anelloviridae parmi plusieurs populations contemporaines, nous a permis d'observer des différences significatives de profils, notamment dans la population afghane. Notre méthodologie d'analyse d'échantillons anciens a mis en évidence la présence de souches Anelloviridae, attestant ainsi leur ancestralité et révélant également l'existence de variabilités inter- et intra-individuelles, similaires à l'infection des populations modernes. / Anelloviridae are small single-stranded DNA viruses, recently discovered, and widely spread among vertebrates. In humans, three distinct genera were characterised: Alphatorquevirus (TTV), Betatorquevirus (TTMV), Gammatorquevirus (TTMDV), leading to a chronic infection whose pathogenicity remains unknown. Their epidemiology is constantly evolving due to their extreme variability and genetic diversity. In this multidisciplinary research, combining virology, bioanthropology and palaeomicrobiology, we have used genetic analysis to explore the natural history of those viruses via two linked issues. On the one hand, the genetic diversity was analysed by way of a cross-sectional study within contemporary populations (French and Afghan) and ancient populations from the Neolithic period to Modern times. On the other hand, their evolution was studied at the individual level through a longitudinal study in two corpora (follow-ups of a transplanted patient and haemodialysis patients). In order to complement data regarding this unique viral family, a methodological process was established to improve and standardize existing analysis protocols. Comparison of Anelloviridae's distributions among several healthy contemporary populations allowed us to notice significant differences of partitions, especially an almost complete absence of TTMDV in the Afghan sample. Our methodology dedicated to ancient remains displayed the presence of Anelloviridae strains, testifying their ancestral origin and highlighting inter- and intra-individual variations, similar to infections in modern populations.