La revue de la littérature montre que la pulpe dentaire est une source utile pour le diagnostic des bactériémies, y compris en paléomicrobiologie. Les précédents travaux en paléomicrobiologie réalisés dans le laboratoire ont tous mis en évidence une amplification possible de courts ou très courts fragments d'ADN bactérien partant de l'hypothèse que l'ADN ancien est fragmenté. Dans le premier travail, le modèle expérimental de dégradation de l'ADN des macrophages murins J774 et de Mycobacterium smegmatis par la chaleur sèche à 90°C a montré une différence statistiquement significative (p < 0.05) entre la vitesse de fragmentation de l'ADN bactérien et eucaryote. Ces résultats suggèrent que les diagnostics paléomicrobiologiques peuvent détecter des fragments plus longs d'ADN bactérien à partir des échantillons anciens. Dans un deuxième travail, un système de détection rapide de 7 agents pathogènes par PCR multiplex en temps réel a été utilisé pour détecter ces pathogènes suspectés à partir de la pulpe dentaire de 1192 dents anciennes collectées dans 12 charniers dont un localisé à Douai (1710 – 1712). Après la détection de Bartonella quintana dans ce charnier, les PCRs en temps réel emboîtées ultra-sensibles et la «PCR suicide» ont été utilisées pour confirmer la présence de Rickettsia prowazekii souche Madrid E génotype B dans 6/55 pulpes dentaires (11%) collectées de 6/21 squelettes (28.6%) de soldats à Douai. Ces résultats supportent l'hypothèse que le typhus a été introduit en Europe par les soldats espagnols au retour des conquêtes en Amérique. / Reviewing the literature shows that dental pulp is a useful source for bacteremic and paleomicrobiological diagnoses. In the first work, an experimental model of DNA degradation of the murine macrophage cell line J774 and Mycobacterium smegmatis by exposure to 90°C dry heat showed a statistically significant difference (p < 0.05) of fragmentation level between bacterial and eukaryotic DNA. These results suggest that paleomicrobiological diagnosis can detect more large fragments of bacterial DNA from ancient buried specimens. In the second work, a system of rapid detection of seven pathogens by multiplex real-time PCR was used for detecting suspected pathogens from dental pulp of 1192 ancient teeth collected from 12 multiple burials including a mass grave in Douai, 1710 – 1712. After the Bartonella quintana detection in this site, real-time nested PCR and ultra-sensitive “suicide PCR” were used to confirm the presence of Rickettsia prowazekii strain Madrid E genotype B in 6/55 dental pulp specimens collected from 6/21 (29%) skeletons of soldiers buried in Douai.These results support the hypothesis that typhus was imported into Europe by Spanish soldiers from America. In the last work, DNA extracted from 5 dental pulp specimens collected from multiple burials at Issoudun, 17th – 18th centuries, was analyzed by pyrosequencing which detected Yersinia pestis sequences in the metagenome. For paleomicrobiology, pyrosequencing is a sensitive technic which can be used as baseline test to detect both suspected and unexpected pathogens from ancient specimens. We named this new approach «paleometagenomics».

La bio-détection de molécules reposant sur le phénomène de résonnance plasmon permet de détecter des espèces en utilisant les propriétés optiques de films métalliques. L’utilisation de ce type de capteurs nécessite néanmoins l’augmentation de leurs performances afin de détecter des concentrations faibles d’analyte dans des milieux complexes. L’assemblage de nanoparticules d’oxyde de fer sur des substrats d’or, en utilisant des groupements complémentaires spécifiques via la méthode de chimie « click », permet de contrôler leur distribution spatiale à la surface du substrat. Les propriétés magnétiques portées par les nanoparticules sont ainsi étudiées en fonction de leurs distances inter-particules ainsi que de leurs tailles. Par ailleurs, le plasmon de surface du substrat étant directement influencé par l’assemblage des nanoparticules, il sera possible de contrôler la sensibilité du capteur pour étudier la détection de différentes biomolécules impliquées dans des processus biologiques. La présence des nanoparticules augmente les propriétés optiques intrinsèques de la surface du substrat et la géométrie de l’assemblage permet d’augmenter la quantité de biomolécules détectées. / Biomolecular detection based on the surface plasmon resonance phenomenon allow detecting species by using the optics properties of metallic thin films. This kind of biosensors require the increase of their performances in order to detect low concentration analyte in complex medium. The assembly of iron oxide nanoparticles on gold substrates by using specific complementary groups via the “click” chemistry technique allows controlling their spatial distribution on the substrate surface. The magnetic properties carried by the nanoparticles are studied as function of their inter-particle distances and their sizes. Moreover, the surface plasmon of the substrate is directly influenced by the nanoparticle assembly and the control of the sensor sensitivity will be possible in order to study the detection of different biomolecules implies in biological processes. The presence of nanoparticles increases the intrinsic optical properties at the substrate surface and the geometry of the assembly allow increasing the number of biomolecules detected.

Arrière-plan: les cellules tumorales circulantes (CTC) sont détectables dans de nombreux cancers et peuvent être utiles cliniquement pour le pronostic de la maladie, pour mesurer la récidive et pour prédire la sensibilité aux medicaments chimiothérapeutiques. Au cours des dernières années, l’études des CTC dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, du poumon, du côlon et de la prostate a grandement évolué. Alternativement, il y peu d'études à ce sujet concernant le cancer du col de l’utérus (CCU). Objectifs: Notre objectif est d’optimiser le processus d'enrichissement des CTC dans le CCU et la détection moléculaire des biomarqueurs E6 et E7. Matériel et Méthodes: Dans l’optique de mimer la présence de CTC dans le sang, nous avons dilué des cellules cancéreuses CaSki VPH16-positif provenant d’un CCU dans du sang humain prélevé sur des volontaires sains. Les CaSki ont été collectées suite à une centrifugation par densité avec le Ficoll, la lyse des globules rouges (RBC) et la lyse des RBC combinée avec un enrichissement positif et négatif à l’aide de marqueurs de surface cellulaire. Les CTC ont été détectées par la mesure d’expression des oncogènes E6 et E7 du virus du papillome humain (VPH), de la cytokératine 19 (CK19) et de la cycline p16INK4 en utilisant la technique quantitative en temps réel de Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Pour valider notre méthode de détection des CTC in vivo, nous avons recruté dix patientes atteintes d’un CCU VPH16 positif et six contrôles sains. Résultats: Dans le modèle de dilutions de cellules CaSki, la lyse des RBC seule ou combinée avec l'enrichissement négatif ou positif suggèrent des limites de détection de 1 CTC par mL de sang pour tous les biomarqueurs moléculaires utilisés. La sensibilité de détection est accrue lors de l'utilisation de l’enrichissement positif et négatif en réduisant le bruit de fond causé par les monocytes sanguins. Contrairement aux oncogènes E6 et E7, les marqueurs CK19 et p16INK4A ont été détectés chez des individus sains, les niveaux d'expression de base appropriés doivent donc être déterminés avec précision par rapport aux patientes CCU. Le gradient de densité par Ficoll a une limite de détection de seulement environ 1000 cellules par mL de sang. Enfin, les CTC ont été détectées dans 2/10 patientes en utilisant le marqueur CK19. Cependant, ces patientes étaient négatives pour les oncogènes E6/E7. Le marqueur p16INK4A était exprimé au même niveau dans tous les échantillons (CCU et normaux). Conclusion: Notre étude suggère que les oncogènes E6 et E7 du VPH16 sont les marqueurs biologiques les plus sensibles et spécifiques en qRT-PCR pour détecter les CTC dans le modèle de dilution de cellules de CCU dans le sang. Chez les patientes atteintes d’un CCU de stade précoce, seulement CK19 a révélé la présence potentielle de CTC, ce qui suggère que ces cellules sont rares à ce stade de la maladie. Mots clés: cancer du col de l’utérus, cellules tumorales circulantes, RT-qPCR, E6 et E7, CK19, p16INK4A, enrichissement immunomagnétique, détection moléculaire. / Background: Circulating tumor cells (CTCs) have been detected in many cancers and are used in multiple clinical applications including disease prognosis, tumor recurrence prediction and prediction of tumor sensitivity to chemotherapeutic drugs. Studies in most major solid cancer(s) (breast, lung, colon and prostate) are progressing rapidly, but there has been very little progress concerning uterine cervical cancer (UCC).Objective: our aim is to optimize enrichment processes and the molecular biomarker-based detection of human circulating tumor cells (CTCs) in uterine cervical cancer (UCC). Material & Methods: To mimic CTCs in patients, we designed an experimental spiking model where the CaSki HPV16-positive UCC cell line was serially diluted and spiked into human blood collected from healthy volunteers. CaSki CTCs were enriched using either Ficoll density centrifugation, red blood cell (RBC) lysis or RBC lysis combined with cell surface markers negative or positive enrichment. CTCs were detected using real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) to measure the gene expression of human papillomavirus (HPV) viral oncogenes (E6 and E7), cytokeratin 19 (CK19), or the cyclin dependent kinase inhibitor p16INK4A. Finally, ten HPV16- positive UCC patients and six healthy controls were recruited to validate CTCs detection in vivo. Result: In the spiking model, RBC lysis alone or combined with negative or positive enrichment suggests detection limits close to 1 CTC per mL of blood for all molecular biomarkers used. The sensitivity of detection increased when using positive and negative enrichment probably by reducing the peripheral blood mononuclear cell-derived RNA background. Unlike HPV oncogenes, CK19 and p16INK4A were detected in normal individuals, thus appropriate basal expression levels need to be accurately determined compared to cancer patients. Alternatively, Ficoll density gradient had a detection limit of only about 1000 cells per mL of blood. Finally CTCs were detected in 2/10 patients using CK19. None of the patients had E6/E7 transcripts and p16INK4A was expressed at similar level across all samples (cancer and healthy). Conclusion: qRT-PCR of HPV16 E6 and E7 is the most sensitive and specific biomarker used to detect CTCs in the spiking model. In early disease UCC patients, only CK19 revealed the presence of CTCs suggesting that these cells are rare at that stage of the disease. Keywords: uterine cervical cancer, circulating tumor cells, qRT-PCR, E6 and E7 oncoprotein, CK19, p16INK4A, immune-magnetic enrichment, molecular detection.

Dans un contexte de réduction de la pression phytosanitaire sur les cultures il est importantde recourir à des méthodes permettant de réduire l’usage des pesticides pour lutter contreles ravageurs. Un des moyens consiste à réguler les ravageurs par leurs ennemis naturels(Lutte biologique par conservation). Le carpocapse du pommier, Cydia pomonella, est unravageur majeur des vergers de pommiers au Sud Est de la France. L’objectif de cette thèseétait de définir les déterminants du parasitisme larvaire de ce ravageur. Nous avonscaractérisé la composition de la communauté des parasitoïdes sur les larves diapausantes etde saison du carpocapse. Cette communauté est majoritairement représentée par troisespèces d’hyménoptères : Ascogaster quadridentata, Pristomerus vulnerator (parasitoïdesprimaires) et Perilampus trisits (parasitoïde secondaire d’A. quadridentata et de P.vulnerator) dans les zones étudiées. Nous avons déterminé les caractéristiques des pratiquesagricoles et des éléments semi-naturels au niveau du verger et du paysage qui affectent letaux de parasitisme et la composition de la communauté de parasitoïdes pour des larvesdiapausantes du carpocapse. Les haies brise-vent et les haies composites autour du vergersemblent jouer sur la composition de la communauté en favorisant par leur présence lesparasitoïdes primaires A. quadridentata et P. vulnerator par rapport au parasitoïdesecondaire P. tristis. La protection phytosanitaire au niveau du verger et du paysageenvironnant a un effet sur le taux de parasitisme. Le taux de parasitisme est plus élevé dansles vergers en agriculture biologique que dans les vergers conventionnels ainsi que dans lesvergers entourés d’une faible proportion de vergers conventionnels dans un voisinage de250 m. Nous avons étudié les dynamiques temporelles de la communauté des parasitoïdesdu carpocapse. Le taux de parasitisme a globalement augmenté au cours de la saison dedéveloppement du carpocapse et il est plus élevé lorsque l’on piège de jeunes larves dans lesfruits que des larves âgées dans les bandes cartonnées enroulées autour des troncs. Lacomposition de la communauté varie au cours du temps. La proportion relative duparasitoïde secondaire P. tristis augmente au cours de la saison en parallèle d’unediminution de la proportion relative d’A. quadridentata. Les émergences des adultes A.quadridentata sont de plus synchronisées avec celles des adultes carpocapses. Enfin, nousavons développé et testé une méthode de PCR-RFLP et des marqueurs ADN spécifiques pourdétecter et identifier les parasitoïdes du carpocapse. La PCR-RFLP permet d’identifier lesparasitoïdes adultes et leurs hôtes. Les marqueurs spécifiques permettent, en outre, ladétection de parasitoïdes dans les oeufs et les jeunes larves de carpocapse. Ces approchesmoléculaires ont également permis d’évaluer le parasitisme dans des populations naturellesde carpocapse et d’estimer les interactions trophiques au sein de la communauté desparasitoïdes / In the context of a more environment-friendly agriculture, it is important to design methodsthat enable us to reduce the use of pesticides to fight pests. One possible way consists inincreasing pest regulation by their natural enemies (Conservation biological control). Thecodling moth, Cydia pomonella, is a major insect pest of apple orchards in SoutheasternFrance. The aim of this thesis was to identify determinants of the larval parasitism of thispest. We characterized the composition of the parasitoid community on diapausing and nondiapausing codling moth larvae. This community is mainly represented by threeHymenoptera species: Ascogaster quadridentata, Pristomerus vulnerator (two primaryparasitoids) and Perilampus trisits (a secondary parasitoid of A. quadridentata and P.vulnerator) in the study sites. We determined the characteristics of agricultural practices andsemi- natural habitats at the orchard and landscape level that affect the parasitism rate andthe composition of the parasitoid community of diapausing codling moth larvae. Thewindbreak and spontaneous hedgerows around the orchard seemed to impact theparasitoid community composition by promoting, when present, the primary parasitoids A.quadridentata and P. vulnerator versus the secondary parasitoid P. tristis. Crop protectionpractices at the orchard and surrounding landscape levels affected the parasitism rate.Parasitism rate was higher in organic orchards than in conventional orchards as well as inorchards surrounded by a low proportion of conventional orchards in a 250 m vicinity. Wefurther studied the within-season temporal dynamics of the codling moth parasitoidcommunity. The parasitism rates globally increased along the season among cohorts ofmature codling moth larvae and were higher in young larvae trapped in fruits than in maturelarvae trapped in band traps around the tree trunks. The community composition variedalong the season. The relative proportion of the secondary parasitoid P. tristis increasedamong the codling moth cohorts whereas the proportion of A. quadridentata decreased.Furthermore, the emergences of adult A. quadridentata were synchronized with theemergences of the adult codling moths. Finally, we developed and tested a PCR -RFLPmethod and specific DNA markers to detect and identify parasitoids of the codling moth. ThePCR -RFLP method was powerful to identify adult parasitoids and their hosts. Specificprimers allowed detection of parasitoids in the eggs and young larvae of codling moth. TheseDNA-based techniques allowed molecular evaluation of parasitism in C. pomonella naturalpopulation and reconstructing quantitative food web of the parasitoid community.

Le Cancer du Col Utérin (CCU) chez la femme est provoqué par le virus oncogénique VPH. La métastase lymphatique ganglionnaire est un facteur pronostique majeur pour l’évolution de ce cancer et sa présence influence la décision thérapeutique. En général, l’envahissement ganglionnaire est diagnostiqué par histologie, mais cette méthode est laborieuse et parfois prise en défaut pour détecter les micrométastases et les cellules cancéreuses isolées et pour donner des résultats rapides en per opératoire. L’outil moléculaire que nous désirons développer pour combler cette lacune est basé sur une analyse d’ARN des gènes du VPH exprimés par les cellules du CCU. Ceci sera fait par transcription réverse de l’ARN cellulaire couplé à une réaction quantitative en chaine par polymérase en temps réel (RT-qPCR). Cette technique devrait nous permettre une détection et une évaluation rapide des micrométastases pour aider à déterminer immédiatement un pronostic fiable et la thérapie associée. C’est un test précis, sensible et rapide pour détecter un envahissement ganglionnaire dans le CCU visant à améliorer la gestion thérapeutique. Le projet est basé sur trois objectifs. En premier lieu, valider les marqueurs moléculaires E6 et E7 de VPH16 et 18 à partir des échantillons frais et des échantillons fixés dans des blocs de paraffine. En deuxième lieu, déterminer la fiabilité et la sensibilité des marqueurs pour la détection des macrométastases, des micrométastases et les cellules tumorales isolées en utilisant la technique de RT-qPCR. En troisième lieu et parallèlement au travail présenté dans ce mémoire, il est nécessaire de constituer une base de données des patientes qui ont le virus VPH16 et 18 intégré dans leur génome, qui ont été traitées et dont nous connaissons déjà le diagnostic final afin de valider la méthode (biobanque). Nous avons réussi à extraire de l’ARNm de haute qualité à partir d’échantillons complexes, à détecter les gènes E6 et E7 de VPH16 et 18 en RT-qPCR, et à déterminer précisément la limite de détection de E6 et E7 dans les échantillons frais qui est une proportion de 0,008% de cellules cancéreuses. Dans les échantillons fixés dans la paraffine, cette limite est de 0,02% et 0,05% pour E6-E7-VPH16 et E6-E7-VPH18 respectivement. Ceci comparativement à une limite de détection histologique de 1% qui est déterminée par immunohistochimie de CK19. Enfin, notre protocole est validé pour VPH18 dans les ganglions lymphatiques du CCU. / The presence of lymph nodes metastasis in uterine cervical carcinoma influences therapeutic management and patient survival. The gold standard for metastasis detection is histology. However, histology lacks sensitivity to detect micrometastasis or isolated cancer cells and is not an efficient method for immediate diagnosis during surgery. The molecular tool that we want to develop to fill this gap is based on an analysis of expressed RNA transcripts derived from the HPV genome in cells of uterine cervical carcinoma (UCC). This will be done by reverse transcription of cellular RNA coupled to a quantitative polymerase chain reaction in real-time (RT-qPCR). This technique could allow detection and rapid assessment of micrometastasis to help determine prognosis and an immediate reliable combination therapy. The proposed technique would be a specific test, sensitive and rapid to detect lymph node involvement in the UCC to improve therapy management. Our objective is to constitute a patient bank containing genetic and clinical information. This genetic information will be used to test and improve new molecular markers for UCC metastasis. These markers will be validated using comparisons to traditional histological results and evaluated for their capacity to detect lymph nodes micrometastasis. Ultimately, we wish to develop a reliable molecular diagnosis method useful during surgery and improve our knowledge about the clinical evolution of metastatic UCC. Currently, we are able to extract high quality mRNA from formalin-fixed cells mounted in paraffin blocks and to detect E6 and E7 from HPV16 and HPV18 using RT-qPCR. We have specifically determined the detection limit of E6 and E7, which is 0.008% in the fresh samples and 0.02% and 0.05% for HPV16-E6-E7 and HPV18- E6-E7 respectively in the samples fixed in paraffin blocks. Comparatively, the histological detection limit was determined to be around 1% using immunohistochemistry for CK19 expression. Finally, our protocol has been validated for HPV18 in UCC patient lymph nodes