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Employing double-stranded DNA probes on colloidal substrates for competitive hybridization eventsBaker, Bryan Alexander 01 April 2010 (has links)
The study of the DNA has found application beyond our understanding of its cellular function and into a variety of materials assembly and nucleic acid detection systems. The current research investigates double-stranded DNA probes in both a colloidal particle assembly and fluorescent assay format utilizing competitive hybridization events. In both contexts, the affinity of the dsProbes is tuned by the sequence design parameters of duplex length and complementarity. These systems were incubated with nucleic acid targets of interest and, based on the mechanism of competitive hybridization, were responsive to the presence of a high affinity competitive target. In the case of the particle assemblies, incubation with the competitive target resulted in observable disassembly of particle structures. In the case of fluorescently labeled dsProbes, incubation with competitive targets resulted in a quantifiable loss of fluorescence as determined by flow cytometry. Utilizing the fluorescently labeled dsProbe system, the kinetics of competitive hybridization was characterized for nucleic acid targets of varying specificity and strand context. The results indicate promise for the development of the competitive hybridization approach in nucleic acid detection systems providing advantages over current single-stranded probe designs. By utilizing a fluorescently labeled dsProbe approach, it is unnecessary to chemically modify the target of interest to impart a signaling mechanism. Additionally, as the process of competitive hybridization of dsProbes with targets of interest is an affinity driven process, discrimination of targets based on specificity is decoupled from standard measures such as elevated temperature protocols, an important step in translating nucleic acid technologies from the controlled laboratory environment to field applications.
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Assemblage permanent de micro-objets par diélectrophorèse associée à une méthode de couplage covalent / Permanent particle assembly thanks to dielectrophoresis combined with a chemical covalent coupling method.Menad, Samia 08 December 2014 (has links)
La réalisation de micro et nanomatériaux avec des propriétés contrôlées nécessite le développement de nouvelles voies d’élaboration dites ascendantes « ou Bottom-up ». Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à maîtriser la formation d’agrégats de particules colloïdales et de cellules, avec des applications potentielles dans les domaines des biocapteurs, de la microélectronique, de l’optique et de l’ingénierie tissulaire. L’approche proposée pour assembler les particules en structures organisées se base sur l’emploi de la diélectrophorèse, reposant sur l’application d’un champ électrique non- uniforme. L’un des inconvénients de cette technique tient au caractère réversible des assemblages ainsi formés, l’annulation du champ électrique entrainant la redispersion des colloïdes. Afin d’apporter une solution à ce problème, il est possible de recourir à un couplage chimique pour maintenir la cohésion des structures formées dans le milieu liquide. Afin de mieux maîtriser le comportement diélectrophorétique et les réactions chimiques exploitées, des travaux de caractérisation électrique et chimique des particules manipulées ont été réalisés. D’autre part, différents types de microélectrodes ont été étudiées pour la génération du champ électrique nécessaire à l’assemblage. Une nouvelle filière technologique a été développée pour la réalisation de microélectrodes transparentes en ITO et leur intégration en système microfluidique, basée sur l’exploitation du pouvoir isolant d’une fine couche de PDMS micro-structurée. La méthode a été appliquée à la fabrication de microélectrodes « verticales » puis à la réalisation de matrices d’électrodes quadripolaires. Ces dernières ont permis d’obtenir des assemblages permanents de particules de polystyrène fluorescentes présentant des groupements carboxyliques en surface, en combinant l’emploi de la diélectrophorèse négative et l’utilisation d’un agent de couplage chimique (Jeffamine). Des agrégats de cellules HEK 293 ont également été réalisés par diélectrophorèse négative. Nous avons démontré qu’il était possible, sous certaines conditions, de préserver le caractère permanent des agrégats cellulaires après coupure du champ. / The design of micro and nanomaterials with controlled properties requires the development of new bottom- up assembly approaches. The work presented in this manuscript aims to control the formation of aggregates of colloidal particles and cells, with potential applications in the fields of biosensors, microelectronics, optics and tissue engineering. The proposed approach for assembling colloids into organized structures is based on the use of dielectrophoresis, a phenomenon observed when polarizable particles are placed in a non-uniform electric field. One of the drawbacks of this technique is the reversibility of the assemblies thus formed, the cancellation of the electric field causing the redispersion of the colloids. As a solution to this problem, we proposed to use a coupling agent to maintain the cohesion of the structures formed in the liquid medium. In order to better control the dielectrophoretic behavior and the chemical reactions exploited, electrical and chemical characterizations of the manipulated particles were carried out. Moreover, different types of microelectrodes have been studied for the generation of the electric field required for the assembly. A new approach has been developed for the fabrication of transparent micro patterned ITO microelectrodes and their integration in microfluidic systems, based on the exploitation of a thin micro-structured PDMS membrane used as an insulating layer. The method has been applied to the fabrication of "vertical" microelectrodes and of quadrupolar electrode arrays. The latter were used to obtain permanent assemblies of carboxylic acid functionalized, fluorescent, polystyrene particles, by combining negative dielectrophoresis with the use of a chemical coupling agent (Jeffamine). HEK 293 cell aggregates were also produced by negative dielectrophoresis. We have demonstrated that it was possible, under certain conditions, to preserve the permanent character of the cell aggregates after field removal.
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