Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-04T13:02:41Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final-Adriana E F Morato.pdf: 2704014 bytes, checksum: 20efa22afe3e61e735f04f4257d1f05a (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-06T12:45:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final-Adriana E F Morato.pdf: 2704014 bytes, checksum: 20efa22afe3e61e735f04f4257d1f05a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T12:45:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final-Adriana E F Morato.pdf: 2704014 bytes, checksum: 20efa22afe3e61e735f04f4257d1f05a (MD5) / CNPq / Atualmente, a produção de enzimas recombinantes é um dos mercados mais promissores para a biotecnologia. Processos catalisados por enzima são aplicados em diversos processos industriais por apresentarem alta eficiência catalítica, especificidade e seletividade, além do baixo consumo de energia, o que contribui positivamente com o Meio ambiente. A maioria dos biocatalisadores aplicados em processos industriais consiste em enzimas imobilizadas em resinas insolúveis. A imobilização aumenta a atividade catalítica, a estabilidade e também torna possível a aplicação da enzima em meio reacional contínuo assim como, sua reutilização no meio de reação. O interesse em torno do aprimoramento da técnica de imobilização e produção de biocatalisadores enzimáticos tem aumentado nos últimos anos, o que permite indicar o processo de purificação enzimática como o passo mais dispendioso na produção de enzimas. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um processo adequado de purificação e imobilização de enzimas recombinantes em passo único, baseados na interação do his-tag com resinas específicas, que permita a produção de catalisadores enzimáticos aplicáveis à produção industrial com baixo custo. Para tanto, foram utilizadas três tipos de resinas da série Amberlite, as quais foram avaliadas quanto à sua interação com os íons Ni2+ ou Co2+, com proteínas inespecíficas e com a enzima lipase B de Pseudosyma antarctica transformada com cauda de hexahistidina. Paralelamente, análises da eficiência catalítica da lipase foram realizadas através da mensuração da atividade hidrolítica por meio de testes de degradação do pNPP e concentração da proteína pelo método colorimétrico de Bradford. No presente estudo, foi realizada uma prospecção tecnológica com o intuito de avaliar o desenvolvimento da tecnologia no mundo. Esse estudo indicou a necessidade de pesquisas no Brasil. Entre os suportes testados, a resina Amberlite IRN77 carregada com íons Ni2+ e pré-tratada com tampão Tris-HCl (pH 7.0) apresentou dados favoráveis quanto a ligação de íons metálicos e proteína inespecífica, sendo utilizada nas etapas de purificação e imobilização enzimática. A lipase PALB purificada na coluna apresentou uma boa atividade catalítica (522U/g) em meio aquoso, mesmo na presença de compostos desnaturantes. Com isso, um suporte de baixo custo foi empregado para o processo de purificação e imobilização enzimática. Este trabalho é um novo passo para o esclarecimento dos processos envolvidos na técnica de purificação e imobilização de enzimas em passo único, além de contribuir para a pesquisa no país por meio de uma patente que está sendo desenvolvida. / Currently, the production of recombinant enzymes is one of the most promising markets for biotechnology. Catalyzed processes by enzymes are applied in many industrial processes because they have high catalytic efficiency, specificity and selectivity, in addition to low power consumption, which contributes positively to the environment. Most of biocatalysts in industrial processes are applied in immobilized enzyme insoluble resins. The immobilization enhances the catalytic activity, stability and also makes possible the use of continuous enzyme reaction medium as well as reuse in the reaction medium. The interest around the improvement of production technique and immobilization of enzyme biocatalysts has increased in recent years, allowing indicate enzymatic purification process as the most expensive step in the production of enzymes. This study aimed to develop an appropriate process of purification and immobilization of recombinant enzymes in one step, based on the interaction of his-tag with specific resins, allowing the production of enzymatic catalysts applicable to industrial production at low cost. For this purpose, three types of resins Amberlite series, which were evaluated for their interaction with Ni2+ ions, were used or Co2+, with nonspecific proteins and their Pseudosyma antarctica lipase B transformed with hexahistidine tail. In parallel, analyses of the catalytic efficiency of lipase were performed by measuring the hydrolytic activity by testing the degradation of pNPP and protein concentration by the Bradford colorimetric method. In the present study, a technological exploration was performed in order to evaluate the development of technology in the world. This study indicated the need for research in Brazil. Among the tested media, the Amberlite IRN77 charged with Ni2+ ions and pre-treated with Tris-HCl buffer (pH 7.0) presented favorable data for binding of metal ions and nonspecific protein being used in purification and immobilization stage of enzyme. The purified lipase PALB column showed good catalytic activity (522U/g) in an aqueous medium, even in the presence of denaturing compounds. With this, a low-cost support was used for the process of purification and enzyme immobilization. This work is a further step towards the understanding of the processes involved in the art for purification and immobilization of enzymes in a one step, as well as contributing to research in the country through a patent that is being developed.

Submitted by BRUNO HENRIQUE DE OLIVEIRA null (bio_henri@yahoo.com.br) on 2017-04-27T19:07:13Z No. of bitstreams: 1 TESE - Bruno Henrique de Oliveira.pdf: 3915403 bytes, checksum: d2b083ce532a0ca65488edb533c50789 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-05-03T14:48:15Z (GMT) / Submitted by BRUNO HENRIQUE DE OLIVEIRA null (bio_henri@yahoo.com.br) on 2017-05-08T12:51:56Z No. of bitstreams: 1 TESE - Bruno Henrique de Oliveira (1).pdf: 3110165 bytes, checksum: c7a30b80af11cc4e7d356a3ba35baccf (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-08T16:17:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_bh_dr_rcla.pdf: 3110165 bytes, checksum: c7a30b80af11cc4e7d356a3ba35baccf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-08T16:17:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_bh_dr_rcla.pdf: 3110165 bytes, checksum: c7a30b80af11cc4e7d356a3ba35baccf (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Com o desenvolvimento de uma metodologia de purificação não convencional de passo único (“MPU”) obteve-se um fator de purificação de 46,5 vezes e recuperação de 53%, observando-se banda única de 32 kDa na eletroforese SDS-PAGE. A enzima purificada apresentou atividade frente a ácidos graxos com cadeias entre 8 e 20 carbonos, destacando-se a seletividade para os ácidos palmítico (16:0) e oleico (18:1). A lipase apresentou ligeira regiosseletividade para as posições externas sn-1 e sn-3 (ésteres primários) do triacilglicerol. A cinética da reação demonstrou que a enzima segue uma cinética de Michaelis-Menten, com valor de Km de 22 mmol e Vmax de 12,7 mmol/min/mg. O valor de kcat foi de 225 s-1 e a eficiência catalítica de 104 mol-1.s-1. A temperatura para atividade máxima foi de 55 °C, sendo razoavelmente estável a 60 °C, mantendo 60% da atividade após 1 h. A atividade máxima foi obtida na faixa de pH entre 4 e 9, mantendo 100% da atividade inicial após incubação por 1 h na faixa de pH entre 2,2 e 10,0. A estabilidade em solventes orgânicos foi estudada por incubação da enzima em solventes miscíveis e imiscíveis em água. A enzima manteve 100% da atividade inicial em tolueno, n-hexano e n-heptano e apresentou estabilidade de 78%, 76% e 90% quando incubada com 50% (v/v) de metanol, etanol e isopropanol. Com relação às aplicações em reações de interesse industrial, a lipase de B. lata apresentou comportamento predominantemente de hidrolase (90%) em detrimento a ação de aciltransferase. Para a síntese de ésteres de aroma produz o éster caprilato de isoamila com 45% de rendimento (24 h e 50 °C em n-hexano). Para a síntese de um éster de cera (oleil oleato, C36), apresentou 87% de rendimento (30 h, 55 °C). A obtenção de ácidos graxos epoxidados alcançou rendimento de 44,4% em reação quimio-enzimática de epoxidação do oleato de metila (48 h, 40 °C e 10% (v/v) de H2O2). A atividade frente a galactolipídeos de espinafre in situ atingiu 2700 U/mg. Em ambientes gástricos simulados apresentou alta atividade e estabilidade em presença de proteases (pepsina e tripsina) em condições de baixo pH, além de demonstrar surpreendente ativação na presença de altas concentrações de sais biliares (NaTDC). / With the development of a non-conventional one-step purification methodology, was obtained a purification factor of 46.5 and recovery of 53%, noting single band of 32 kDa in SDS-PAGE. The purified enzyme showed activity against fatty acids with chains from 8 to 20 carbons, highlighting the preference for palmitic (16:0) and oleic acids (18:1). The lipase showed slight regioselectivity for external positions sn-1 and sn-3 (primary esters). The reaction kinetics showed that the enzyme follows a Michaelis-Menten model with Km value of 22 mmol and Vmax of 12.7 mmol/min/mg. The kcat value was 225 s-1 and the catalytic efficiency was 104 mol-1.s-1. The temperature for maximum activity was 55 °C, and reasonably stable at 60 °C, keeping 60% of activity after 1 h. The maximum activity was obtained at pH values between 4 and 9, maintaining 100% of the initial activity after 1 h incubation in a pH range from 2.2 to 10.0. Stability in organic solvents was studied by incubating the enzyme in miscible and immiscible solvents. The enzyme retained 100% activity in toluene, n-hexane and n-heptane and was 78%, 76% and 90% stable when incubated with 50% (v/v) methanol, ethanol and isopropanol, respectively. Regarding the applications in industrial interest reactions, B. lata lipase presented predominantly hydrolase behavior (90%) over acyltransferase action. For the flavor esters synthesis, the isoamyl caprylate ester is produced with 45% yield (24 h and 50 °C). For a wax ester synthesis (oleyl oleate, C36) showed 87% yield (30 h, 55 °C). The epoxidized fatty acids obtainment reached 44.4% yield in methyl oleate chemo-enzymatic epoxidation (48h, 40 °C and 10% (v/v) H2O2). The activity against spinach galactolipids in situ reached 2700 U/mg. In simulated gastric environment showed high activity and stability in the presence of proteases (pepsin and trypsin) in low pH conditions, besides demonstrating surprising activation in the presence of high concentrations of bile salts (NaTDC). / CNPq: 140129/2013-8