Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Todos os animais com células nervosas e musculares possuem a enzima acetilcolinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) e essa seqüência de aminoácidos está presente em muitas outras proteínas, com ou sem atividade catalítica, fato que permite que essa proteína seja utilizada em estudos de filogenia e de evolução. A grande diferença de afinidade entre substratos e inibidores é utilizada como um biomarcador para estudos genéticos de vários grupos de animais, especialmente insetos. Peixes possuem uma grande diferença na sensibilidade da AChE ao metil-paraoxon (MP) em relação aos animais terrestres e essa diferença pode estar relacionada à evolução. As constantes cinéticas de inibição (CCI) para o mecanismo de inibição progressivamente irreversível da AChE cerebral ao MP foram determinadas em duas fontes de AChE como um modelo para avaliação do potencial de uso das CCI como biomarcador para estudos evolucionários e filogenéticos. As CCI da AChE cerebral de seis exemplares de tainha (Mugil liza), coletados em duas lagoas da costa do Estado do Rio de Janeiro (Araruama e Saquarema), em tempos diferentes (2005 e 2007, respectivamente), foram determinadas em dois laboratórios distintos (CESTEH - FIOCRUZ e Dept. Bioquímica - UERJ). As CCI, medidas separadamente em cada exemplar, indicaram que essas constantes são preservadas em todos os exemplares de uma mesma espécie e que a metodologia empregada pode ser conduzida em laboratórios distintos sem grandes variações. A AChE cerebral de tainha foi tomada como um exemplo de enzima menos sensível (IC50 = 2118nM) e a de galinha comercial (Gallus gallus domesticus) como um exemplo de uma enzima muito mais sensível ao MP (IC50 = 26nM). Alguns testes foram feitos para a validação dessa metodologia. A AChE cerebral dessas duas fontes de enzima foi parcialmente purificada descartando o sobrenadante do homogeneizadoe solubilizando o sedimento com o detergente Triton X-100. A inibição da atividade de AChE nessas preparações pelo substrato acetiltiocolina, comportamento típico da AChE, comprovou a homogeneidade dessa atividade enzimática como representativa da AChE verdadeira em cada animal. A utilização do MP permitiu aferir as soluções de inibidorcom métodos colorimétricos no momento do uso e a preparação solúvel de AChE eliminou artefatos insolúveis que atrapalham a quantificação da enzima. Algumas características matemáticas do cálculo das CCI foram discutidas e um modelo foi validado para ser utilizado em estudos de evolução e filogenia de peixes marinhos da costa brasileira. Como a AChE cerebral de todos os animais terrestres, cujos resultados estão disponíveis, é muito mais sensível ao MP, exemplares de uma espécie de baiacu (baiacu-arara, Lagocephaluslaevigatus) foram testados como um exemplo de peixe mais jovem na escala evolutiva. Os resultados das CCI da AChE cerebral para essa espécie (IC50 = 2243nM) indicaram que entre os peixes a idade evolutiva não está correlacionada com a sensibilidade aos organofosforados. A AChE mais sensível entre os peixes testados foi a de um tipo de bagre (bagre-branco, Genidens barbus, IC50 = 606nM) e a enzima do cação-frango (Rhizoprionodonporosus), exemplo de um peixe mais antigo na evolução, apresentou uma sensibilidade intermediária (IC50 = 1280nM). Estudos com outras espécies correlacionadas com aquelas que se mostraram mais sensíveis ao MP terão que ser feitos para uma resposta mais adequada sobre o uso das CCI de inibição da AChE cerebral por MP como possível marcador evolutivo e filogenético. / The enzyme acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) is present in all animals with neurons and muscle cells, and many other proteins have the same sequence, with or without catalytic activity, allowing them to be used for phylogenetic and evolutionary studies. The great difference between substrates and inhibitor affinities makes it useful as a biomarker for genetic studies of various animals groups, especially insects. There are great differences among fish in AChE sensitivity to methyl-paraoxon (MP) in relation to terrestrial animals, and these differences can be related to evolution. The inhibition kinetic constants (IKC) for progressive irreversible inhibition of brain AChE with MP were determined in these two AChE sources as models for evaluating IKC as potential biomarkers in evolutionary and phylogenetic studies, especially among fish. IKC of brain AChE from six specimens of Mugil liza, a very common coastal fish, was collected from two of Brazil's lagoons in Rio de Janeiro State during 2005 at Araruama and 2007 at Saquarema. First samples were assayed at CESTEH - Fundação Oswaldo Cruz and the latter at Dept. Bioquímica - Universidade do Estado do Rio de Janeiro. The IKC was measured separately for each fish showing that these constants were maintained for all animals of the same species and that this methodology can be used in different laboratories without variations. The cerebral AChE of tainha was used as an example of a less sensitive enzyme (Concentration which inhibits 50% of enzyme activity after 30 minutes of incubation, or IC50, = 2118nM). The commercial hen (Gallus gallus domesticus) was used an example of a very highly sensitive enzyme to MP (IC50 = 26nM). Some tests were carried out to validate this methodology. The cerebral AChE of these two sources of enzyme was partially purified discarding the supernatant of the homogenate and solubilizing the pellet with Triton X-100 detergent. The AChE activity inhibition in these preparations by excess of the substrate acetylthiocholine, a typical AChE behaviour, proved the homogeneity of this preparation and that it is representative of the real AChE of each animal. Using MP allows checking out the solutions of inhibitor with colorimetric methods in the moment of use. The preparation of soluble AChE eliminates insoluble matters which confound the enzyme quantification. Some characteristics of mathematical calculations of IKC were defined to create a valid model that is able to be used for evolutionary and phylogenic studies of fish and other animals. The cerebral AChE of all terrestrial animals, whose results are available, is highly sensitive to MP. To compare with a similar recently evolved fish, a sample of baiacu (baiacu-arara, Lagocephalus laevigatus) was tested for IKC and the results (IC50 = 2243nM) indicated that evolutionary age of the fish does not correlate with sensitivity to organophosphorus compounds. The most sensitive AChE among the fish tested was a type of catfish (bagre-branco, Genidens barbus, IC50 = 606nM) and the enzyme of an older evolved fish, a small shark (cação-frango, Rhizoprionodon porosus), had an intermediate sensitivity (IC50 = 1280nM). Studies with other species correlated to those being more sensitive to MP have to be made to get adequate answers about the use of IKC for cerebral AChE inhibition by MP as a possible evolutionary and phylogenetic marker.