Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-07-14T12:35:49Z No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T12:43:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T12:43:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) é o subtipo mais prevalente de Epilepsia em adultos e sua relevância clínica deve-se à sua gravidade e alta porcentagem de pacientes resistentes aos fármacos antiepilépticos disponíveis atualmente. Há, portanto, uma necessidade pela busca de novas terapias farmacológicas capazes de controlar essa condição patológica de forma eficiente, assim como de compreender melhor as alterações causadas pelo funcionamento anormal das estruturas neuronais durante a Epilepsia. Nesse aspecto, os artrópodes peçonhentos representam uma fonte alternativa de compostos neuroativos selecionados pela evolução dessas espécies. A potencialidade farmacológica dessas moléculas reforça o interesse em compreender sua ação no sistema nervoso central, foco desse trabalho. O Laboratório de Neurofarmacologia isolou o peptídeo Neuropolybina a partir da peçonha da vespa Polybia paulista, e ele apresentou uma interessante atividade antiepiléptica em modelos agudos de crises epilépticas. Além disso, não apresentou efeitos adversos na exploração espontânea e na coordenação motora dos animais testados. Portanto, o objetivo foi avaliar a efetividade antiepiléptica da Neuropolybina em camundongos submetidos ao modelo crônico de Status Epilepticus (SE) induzido por pilocarpina. Esse modelo é amplamente utilizado na literatura e apresenta similaridades com achados histopatológicos e comportamentais observados em pacientes epilépticos em apenas algumas semanas, enquanto as mesmas alterações levam anos para se manifestar nos pacientes. A Comissão de Ética no Uso Animal (CEUA/UnB) aprovou todos os experimentos. Camundongos Swiss receberam a administração i.p. de pilocarpina e após 10 minutos, manifestaram sinais do SE, que durou três horas (período agudo do modelo). No período de 15 dias após o SE (período latente), foi realizado um procedimento estereotáxico para implantar uma cânula-guia no ventrículo lateral e oito eletrodos profundos e corticais. Após os 15 dias, durante o período das crises recorrentes e espontâneas (CRE), os camundongos foram tratados por cinco dias consecutivos com administração i.c.v. de veículo, Neuropolybina (0,5 e 2,5 nmol) e Diazepam (4 mg.kg-1). Durante esse período, o comportamento, as CRE e a atividade epileptiforme foram monitoradas por filmagem e eletroencefalografia. Após o período de tratamento, os camundongos foram eutanasiados e as alterações morfológicas foram avaliadas por técnicas histológicas (Coloração de Nissl para neurônios) e Imunohistoquímica/imunofluorescência (GFAP para astrócitos e DAPI para núcleos celulares). Foi observada uma redução da duração das CRE após o tratamento com Neuropolybina. O número de neurônios viáveis nas regiões CA1 e CA3 da formação hipocampal dos tratados foi significativamente diferente dos doentes, e a presença de astrócitos não foi diferente quando comparada aos sadios, sugerindo que o peptídeo evitou a perda neuronal induzida pelo SE. O peptídeo produziu um efeito antiepiléptico e possui um potencial terapêutico no modelo de ELT. Ademais, ele pode ser usado como uma ferramenta na pesquisa em neurociência e no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da Epilepsia. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Temporal Lobe Epilepsy (TLE) is the most prevalent subtype of Epilepsy in adults and its clinical relevance is due to the gravity and the high percentage of patients resistant to antiepileptic drugs currently available. Thus, there is a need to seek new pharmacological therapies able to efficiently control this disease, as well as a better understanding of the changes caused by the abnormal functioning of neuronal structures during Epilepsy. In this aspect, venomous arthropods represent an alternative source of evolutionary selected neuroactive compounds. The pharmacological potentiality of these molecules reinforce the interest on its action on the central nervous system, focused by this work. The Neuropharmacology Laboratory previous isolated Neuropolybin from the Polybia paulista wasp venom and this peptide has demonstrated an interesting antiepileptic activity on acute models of seizures. Furthermore, Neuropolybin has not presented side effects on spontaneous exploration and motor coordination of the animals tested. Therefore, the aim was to evaluate the antiepileptic effectiveness of the peptide Neuropolybin in mice submitted to a chronic model of status epilepticus (SE) induced by pilocarpine. This model has been used frequently and presents similarities with histopathological and behavioral findings in epileptic patients in just a few weeks, while the same changes take years to manifest in patients. The Ethical Committee on Use of Animals (CEUA/UnB) approved all procedures. Swiss mice received an i.p. injection of pilocarpine and after 10 minutes, they manifested signs of SE for three hours (acute period of the model). Fifteen days after SE (latent period), a stereotaxic procedure was perfomed to implant a guide cannula in the lateral ventricle and eight deep and cortical electrodes. After 15 days, already during the spontaneous recurrent seizures (SRS), treatment was carried out during five consecutive days by i.c.v. injections with vehicle solution, Neuropolybin (0.5 and 2.5 nmol) or Diazepam (4 mg.kg-1). During this period, behavioral, SRS and epileptiform activity were monitored by video recording and electroencephalography. After the period of treatment, the animals were euthanized and morphological changes were evaluated by histological (Nissl stain for neurons) and immunohistochemistry and immunofluorescence (GFAP stain for astrocytes and DAPI stain for cells nuclei) techniques. There was a reduction in SRS duration with Neuropolybin treatment. The number of viable neurons in CA1 and CA3 regions of the hippocampus formation of treated mice was significantly different from that of epileptic mice after the treatment. The presence of astrocytes did not increase when compared to healthy animals, suggesting that the peptide minimized neuronal loss induced by SE. Neuropolybin thus exerts a promising antiepileptic effect and provides a therapeutic potential on this model of TLE. Nevertheless, the peptide may also be used as a tool in neuroscience research and as a framework in the design of novel drug agents for epilepsy treatment.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biologias, Programa de Pós Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-24T14:39:43Z No. of bitstreams: 1 2014_JulianadeCastroeSilva.pdf: 31898664 bytes, checksum: fa1b836c99956f9529ca104b3379326e (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-24T15:02:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JulianadeCastroeSilva.pdf: 31898664 bytes, checksum: fa1b836c99956f9529ca104b3379326e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-24T15:02:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JulianadeCastroeSilva.pdf: 31898664 bytes, checksum: fa1b836c99956f9529ca104b3379326e (MD5) / A epilepsia é uma desordem associada a uma disfunção do Sistema Nervoso Central que, de acordo com a OMS, afeta 50 milhões de pessoas no mundo. E apesar da grande disponibilidade de fármacos, o tratamento ainda e ineficaz para parte dos diversos fenômenos clínicos da epilepsia, sendo de grande importância a busca por novas alternativas que possam gerar medicamentos com maior eficácia e menos efeitos adversos. Recentemente, um promissor peptídeo antiepiléptico foi isolado da peçonha da vespa social Polybia paulista, denominado Neuropolybina. A fim de elucidar o mecanismo de ação e aprofundar o conhecimento da eficácia antiepiléptica com estudos eletroencefalograficos e comportamentais, esse peptídeo e um analogo, com modificações em sua seqüência, foram sintetizados (Aminotech Ltda). Para os testes de proteção contra crises induzidas quimicamente (PTZ, sc, 95 mg/kg; Pilo, ip, 250 mg/kg) camundongos Mus musculus (Swiss) foram submetidos a uma neurocirurgia para a implantação de uma canula-guia no ventrículo lateral direito e administração dos peptídeos via icv. Curvas de proteção foram obtidas a partir da utilização de três doses dos peptídeos (2,5, 1,25 e 0,4 nmol/animal para o peptídeo Neuropolybina e 3, 1,5 e 0,5 nmol/animal para o peptídeo modificado). Ambos compostos aumentaram o tempo de latência para o inicio das crises de maneira dose-dependente. Os peptídeos não protegeram contra as crises induzidas por pilocarpina em nenhuma das doses testadas. Para os testes eletroencefalograficos, ratos Wistar machos receberam a DE50 dos peptídeos e posteriormente o PTZ (sc, 105 mg/kg). Observou-­‐se que a latencia para a crise eletroencefalografica foi a mesma para a comportamental, e que o tratamento com Neuropolybina aumentou a latencia para a crise maxima, e ambos os peptideos reduziram a severidade das crises. Tambem foram feitos testes para verificar se os compostos seriam capazes de atravessar a barreira hematoencefalica, mas quando injetados ip não protegeram contras crises induzidas por PTZ. E ainda, na tentativa de elucidar o mecanismo de ação de tais compostos, ensaios de ligação a receptores de glutamato e GABA e de captação de glutamato foram realizados, mas não foram obtidos resultados significativos. Alem disso, a avaliação neurotoxica dos peptídeos no teste do campo aberto revelou que a maior dose de proteção contra crises não afeta o comportamento normal do animal, apenas a dose dez vezes maior. Na avaliação citotóxica os peptídeos não foram hemolíticos nas concentrações testadas (1, 5 a 50 nmol/poco) em eritrócitos de camundongos. Sendo assim, os peptídeos sintéticos testados apresentaram uma alta eficácia no modelo de epilepsia, com reduzidos efeitos adversos, corroborando os dados previamente obtidos e, portanto, representa uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de novos fármacos neuroativos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Epilepsy is a disorder associated with a dysfunction of the central nervous system which, according to the WHO, affects 50 million people worldwide. And despite the widespread availability of AEDs, the treatment is still ineffective for the several clinical phenomena of epilepsy, being of great importance the search for new alternatives that can generate drugs with fewer adverse effects. Recently a promising antiepileptic peptide was isolated from the venom of the social wasp Polybia paulista, named Neuropolybin. To elucidate the mechanism of action and increase knowledge of the antiepileptic efficacy with electroencephalographic and behavioral studies, this peptide and an analogue, with modifications in its sequence, were synthesized (Aminotech Ltda). For the protection tests against chemically induced seizures (PTZ, sc, 95 mg/kg; Pilo, ip, 250 mg/kg) mice underwent neurosurgery for the implantation of a guide cannula in the right ventricle for administration of peptides (icv). Protection curves were obtained byusing three doses of the peptides (2.5, 1.25 and 0.4 nmol/animal for Neuropolybin and 3, 1.5 and 0.5 nmol/animal for the modified peptide). Both compounds increased the latency to onset of seizures in a dose‐dependent manner. The peptides did not protect against pilocarpine induced seizures at any of the doses tested. For electroencephalographic recordings male Wistar rats received the ED50 of the peptides and then PTZ (sc, 105 mg/kg). It was noted that the latency for behavioral and electrographic seizures was the same, the Neuropolybin treatment increased the latency to the maximum seizure and both peptides reduced the severity of seizures. Tests were also performed to verify if the compounds would be able to cross the blood brain barrier but when injected systemically did not protect against PTZ‐induced seizures. Aditionally, in an attempt to elucidate the mechanism of action of these compounds binding assays of glutamate and GABA receptors and glutamate uptake were done but no significant results were obtained. Furthermore, the assessment of neurotoxicity of the peptides on the open field test revealed that the highest dose of protection against seizures does not affect the normal behavior of the animal, only the ten times higher dose. In cytotoxic evaluation peptides were not hemolytic at different concentrations (1.5 to 50 nmol/well) in erythrocytes of mice. Thus, the synthetic peptides tested showed high efficacy in the epilepsy model with reduced adverse effects, confirming the data previously obtained, and therefore Neuropolybin may represents a promising tool for the development of new neuroactive drugs.