La maladie d’Alzheimer (MA) constitue la forme la plus commune de démence associée à une perte de mémoire et caractérisée par l’accumulation de plaques extracellulaires contenant des peptides bêta-amyloïdes (Aβ). Des études ont révélé une perte plus importante de synapses que ne peut l’expliquer la mort neuronale, suggérant qu’un déficit synaptique serait présent dès les stades initiaux de la maladie. Bien que le peptide Aβ fût identifié comme un composé des plaques amyloïdes extracellulaires dans les années 1980, des études plus récentes ont mis en évidence la présence intracellulaire de ce peptide. L’accumulation d’Aβ intracellulaire serait un événement antérieur à la formation des plaques séniles dans la pathogenèse de la MA et corrèlerait mieux avec les perturbations de mémoire et d’apprentissage caractéristiques de cette maladie. De plus, des données mettent en évidence la responsabilité des formes oligomériques solubles d’Aβ (Aβo) dans les évènements précoces de la MA. Ce projet vise à mieux comprendre et caractériser l’impact extracellulaire et intracellulaire des peptides Aβo et le lien fonctionnel de leurs effets sur les mécanismes moléculaires impliqués dans les processus mnésiques affectés dans la maladie d’Alzheimer. Dans ce contexte, il nous a paru essentiel d’étudier l’impact extracellulaire et intracellulaire des oligomères d’Aβ sur la transmission synaptique. Ces travaux ont été effectués sur culture primaire de neurones corticaux et sur tranche de cortex de souris par des méthodes d’électrophysiologie via la technique de patch-clamp.Nous avons analysé la fréquence et l’amplitude des courants post-synaptiques excitateurs spontanés (sEPSC) des principaux récepteurs impliqués dans la transmission glutamatergique et dans les mécanismes moléculaires à la base de la mémoire et de l’apprentissage : les récepteurs AMPA et NMDA. Nos données montrent que les peptides Aβo dans le milieu extracellulaire (eAβo) ou dans le milieu intracellulaire (iAβo), affectent spécifiquement les courants associés à l’activation des récepteurs NMDA au niveau postsynaptique sans altérer les courants AMPA. L’application dans le milieu extracellulaire d’Aβo réduit l’amplitude des courants NMDA. Ce phénomène n’est pas lié à la pénétration du peptide Aβo dans les neurones mais à l’activation par l’Aβo de la voie amyloïdogénique induisant une accumulation intrasynaptique d’Aβo responsable de la réduction des courants NMDA.L’ensemble de ces données suggère que l’Aβo perturbe le processing d’APP menant à une production intracellulaire d’Aβo responsable de la réduction de la transmission glutamatergique NMDA-dépendante. Une étape essentielle afin d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires qui sont à la base des altérations synaptiques glutamatergiques dans la MA est d’approfondir le lien fonctionnel entre les effets extracellulaire et intracellulaire des peptides Aβo. / Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia associated with memory loss and characterized by an accumulation of extracellular plaques composed of amyloid-beta peptides (Aβ). Studies have revealed a greater loss of synapses than the neuronal death can explain, suggesting that a synaptic deficit would be present from the early stages of the disease. Although the Aβ peptide has been identified as a component of the extracellular amyloid plaques in the 1980s, recent studies have highlighted the intracellular presence of this peptide. The intracellular accumulation of Aβ precedes the appearance of amyloid plaques in the pathogenesis of AD and seems to be correlated with the memory and learning troubles, characteristic of this disease. Moreover, some data highlight the responsibility of the soluble oligomeric Aβ form (Aβo) in the early events of AD. This project aims to better understand and characterize the extracellular and intracellular impact of Aβo peptides and the functional link of their effects on the molecular mechanisms involved in memory processes affected in AD. In this context, it was essential to study the extracellular and intracellular impact of Aβ oligomers on synaptic transmission. This work was carried out on cultures of primary cortical neurons and mouse cortex slices using electrophysiological methods via the patch-clamp technique.We have recorded the spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSC) frequency and amplitude from the main receptors implicated in the glutamatergic transmission and in the molecular mechanisms underlying memory and learning processes: AMPA and NMDA receptors. Our data show that external or internal application of Aβo peptides affect specifically the currents associated with NMDA receptors at a postsynaptic level without altering the AMPA currents. The external application of Aβo reduces the NMDA current amplitude. This phenomenon is not due to the penetration of the Aβo peptide into the neurons but rather to the activation of the amyloïdogenic pathway by Aβo inducing an intracellular accumulation of Aβo responsible of the NMDA current reduction.All these data suggest that Aβo perturb the processing of APP leading to an intracellular Aβo production responsible of the glutamatergic NMDA-dependent transmission reduction. An essential step in order to improve our understanding of the molecular mechanisms underlying the altered glutamatergic synaptic alterations found in AD is to deepen the functional link between the extracellular and intracellular effects of the Aβo peptides.

Les oligomères solubles de peptide Bêta-amyloïde (A-bêta) apparaissent comme les acteurs majeurs de la perte synaptique précoce observée au cours de la maladie d'Alzheimer. Notre équipe a précédemment montré que ces oligomères de peptide A-bêta activent la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2), qui entraîne la libération d'acide arachidonique à partir des phospholipides membranaires. En utilisant un modèle d'injection intra cérébro ventriculaire unique d'une faible quantité de peptide A-bêta, nous avons pu observer que l'inactivation constitutive du gène de la cPLA2 protége les souris KO contre les perturbations mnésiques et empêche la réduction de l'expression de protéines synaptiques au sein de l'hippocampe, ces deux effets délétères étant constatés chez les animaux wild-type. Par la suite, nous avons montré que l'activation des sphingomyélinases, consécutive à l'exposition aux oligomères A-bêta, est indétectable dans des neurones en culture issus de souris KO. Dans ces mêmes neurones KO, nous avons constaté que la phosphorylation de Akt/PKB n'est pas altérée suite à l'exposition des cellules aux oligomères A-bêta. Enfin, nous avons pu mettre en évidence une diminution de l'expression de la protéine précurseur du peptide A-bêta (protéine APP), tant au niveau d'homogénats hippocampiques que de neurones en cultures, issus de souris KO. Néanmoins, des travaux supplémentaires sont requis pour établir le lien exact entre cette réduction de l'expression d'APP et la résistance aux oligomères A-bêta, tant in vitro qu'in vivo. Toutefois, ces résultats soulignent l'implication de la cPLA2 dans la neuro dégénérescence entrainée par les oligomères A-bêta, et font apparaitre cette enzyme comme une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de la maladie d'Alzheimer / Soluble beta-amyloid (A-beta) oligomers putatively play a critical role in the early synapse loss and cognitive impairment observed in Alzheimer's disease. We previously demonstrated that A-beta oligomers activate cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) which specifically releases arachidonic acid from membrane phospholipids. By using a single A-beta oligomers intra cerebro ventricular injection, we observed that cPLA2 gene suppression prevents both the alterations of cognitive abilities and the reduction of hippocampal synaptic markers levels which are observed in wild type mice. We further demonstrated that the A-beta oligomers-induced sphingomyelinase activation is suppressed and that the phosphorylation of Akt/PKB is preserved in neuronal cells isolated from KO mice. Interestingly, expression of the A-beta precursor protein (APP) is reduced in hippocampus homogenates and neuronal cells from KO mice, but the relationship with the resistance of these mice to the A-beta oligomers toxicity requires further investigation. These results therefore show that cPLA2 plays a key role in the A-beta oligomers-associated neurodegenerative effects, and as such represents a potential therapeutic target for the treatment of Alzheimer's disease

Une des caractéristiques histopathologiques de la maladie d'Alzheimer (AD) est la présence de plaques amyloïdes formées par les peptides amyloïdes β (Aβ) de 40 et 42 résidus, qui sont les produits de clivage par des protéases de l'APP. Afin de comprendre le rôle des variations structurelles du TM dans le traitement de l'APP, les peptides APP_TM4K ont été étudiés dans la bicouche lipidique en utilisant l’ATR-FTIR et ssNMR. Tandis que la structure secondaire globale du peptide APP_TM4K est hélicoidale, hétérogénéité de conformation et d'orientation a été observée pour le site de clivage γ et , que peuvent avoir des implications dans le mécanisme de clivage et donc dans la production d’Aβ. Les peptides Aβ s'agrègent pour produire des fibrilles et aussi de manière transitoire d'oligomères neurotoxiques. Nous avons constaté qu'en présence de Ca2+, l’Aβ (1-40) forme de préférence des oligomères, tandis qu'en absence de Ca2+ l'Aβ (1-40) s’agrège sous forme de fibrilles. Dans les échantillons sans Ca2+, l’ATR-FTIR révèle la conversion des oligomères en feuillets β antiparallèles en la conformation caractéristique des fibrilles en feuillets β parallèles. Ces résultats nous ont amené à conclure que les Ca2+ stimulent la formation d'oligomères d'Aβ (1-40), qui sont impliqués dans l’AD. Les positions et une orientation précise de deux nouveaux médicaments puissants modulateurs de la γ-sécrétase - le benzyl-carprofen et le sulfonyl-carprofen  dans la bicouche lipidique, ont été obtenus à partir des expériences des ssNMR. Ces résultats indiquent que le mécanisme probable de modulation du clivage par la y-sécrétase est une interaction directe avec le domaine TM de l’APP. / A histopathological characteristic of Alzheimer’s disease (AD) is the presence of amyloid plaques formed by amyloid β(A) peptides of 40 and 42 residues-long, which are the cleavage products of APP by proteases. To understand the role of structural changes in the TM domain of APP, APP_TM4K peptides were studied in the lipid bilayer using ATR-FTIR and ssNMR. While the overall secondary structure of the APP_TM4K peptide is helical, conformational and orientational heterogeneity was observed for the y- and for the -cleavage sites, which may have implications for the cleavage mechanism and therefore the production of Aβ. Starting from its monomeric form, Aβ peptides aggregate into fibrils and / or oligomers, the latter being the most neurotoxic. We found that in the presence of Ca2 +, Aβ (1-40) preferably forms oligomers, whereas in the absence of a2 + Aβ (1-40) aggregates into fibrils. In samples without Ca2 +, ATR-FTIR shows conversion from antiparallel β sheet conformation of oligomers into parallel β sheets, characteristic of fibrils. These results led us to conclude that Ca2 +stimulates the formation of oligomers of Aβ (1-40), that have been implicated in the pathogenesis of AD. Position and precise orientation of two new drugs  powerful modulators of γ-secretase  benzyl-carprofen and carprofen sulfonyl  in the lipid bilayer were obtained from neutron scattering and ssNMR experiments. These results indicate that carprofen-derivatives can directly interact with APP. Such interaction would interfere with proper APP-dimer formation, which is necessary for the sequential cleavage by β -secretase, diminishing or greatly reducing Aβ42 production.