L'élastine est la protéine de la matrice extracellulaire responsable de l'élasticité des tissus. Elle est synthétisée en abondance dans les tissus soumis à de fortes contraintes mécaniques tels que la peau, les poumons, et les artères. Ce biopolymère présente une demi-vie longue de 70 ans et est par conséquent sujet aux altérations liées à l'âge. De plus, l'élastine est dégradée lors de la progression tumorale, notamment celle du mélanome. Sa dégradation entraîne la libération de peptides dérivés de l'élastine (EDP) dotés d'activités biologiques propres et pouvant être impliqués dans l'invasion tumorale (prolifération, angiogenèse, sécrétion de protéases, invasion, survie). Nous avons été les premiers à démontrer que les EDP sont capables de fortement promouvoir le développement de mélanome in vivo dans un modèle murin au travers de l'augmentation de la prolifération et de l'invasion des cellules tumorales impliquant la collagènase-1 ou MMP-1. Ces données suggèrent ainsi que le récepteur de ces peptides, le complexe récepteur de l'élastine (CRE), pourrait constituer une cible thérapeutique innovante afin de lutter contre ce cancer pour lequel un manque flagrant de thérapies efficientes prévaut à l'heure actuelle. Dans le cadre de cette étude, nous avons développé différentes stratégies thérapeutiques basées sur le ciblage du récepteur CRE. Nous démontrons pour la première fois que le ciblage thérapeutique du CRE permet de limiter de manière efficace la progression du mélanome in vitro et in vivo dans un modèle murin. De plus, le vieillissement étant un des facteurs de risque majeur du mélanome, nous avons évalué l'impact de l'âge du stroma sur les effets des EDP et le développement tumoral associé. / Elastin is the extracellular matrix protein responsible for tissue elasticity. It is abundant in tissues experiencing important mechanical constraints such as skin, lungs and arteries. This biopolymer possesses a half-life of 70 years and, consequently, it is subjected to age-related alterations. Moreover, elastin is degraded during tumor progression, notably that of melanoma. Its degradation results in the release of elastin-derived peptides (EDP) which possess their own biological activities that can be linked to tumor invasion (proliferation, angiogenesis, proteases secretion, invasion, survival). We have been the first to show that EDP can promote melanoma development in an in vivo mouse model by raising the proliferation and invasion of tumor cells through collagenase-1 (MMP-1) up-regulation. These data thus suggest that the receptor for these peptides, the elastin receptor complex, could constitute a novel therapeutic target to fight against this type of cancer for which no therapies are efficient now. In this study, we have developed therapeutic strategies targeting the ERC complex. We show for the first time that the therapeutic targeting of the ERC could efficiently limit melanoma progression in an in vitro and in vivo murine model. Additionally, as aging is one of melanoma major risk factors, we have evaluated the impact of stromal age on EDP effects and the associated tumor development.

La Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) est une pathologie inflammatoire chronique caractérisée par une détérioration irréversible des voies aériennes et des espaces alvéolaires. L'emphysème est la composante principale de la BPCO et l'exposition à la fumée de cigarette en est le principal facteur étiologique. La réponse inflammatoire au cours de la BPCO est caractérisée par une infiltration massive du tissu respiratoire par les cellules inflammatoires qui sécrètent de nombreuses protéases. Ces protéases participent à la dégradation des composants de la matrice extracellulaire et en particulier à la dégradation de l'élastine. Cette dégradation conduit à la genèse de peptides solubles d'élastine (PE) retrouvés dans les différents liquides biologiques de patients BPCO. Si les lymphocytes T CD4+ et les PE sont décrits dans la littérature comme impliqués dans la physiopathologie de la BPCO, en revanche, l'impact de leur interaction sur la polarisation Th reste à élucider. Le travail réalisé au cours de cette thèse a permis de mettre en évidence une polarisation de la réponse lymphocytaire T vers un profil de type Th1 et Th17 au cours de l'emphysème murin induit par le peptide d'élastine VGVAPG. Cette polarisation est dépendante de l'interaction du VGVAPG avec son récepteur spécifique à la surface des lymphocytes T, et est inhibée en présence d'analogues antagonistes du récepteur à l'élastine. Ces résultats permettent d'envisager l'utilisation de tels antagonistes comme des agents pharmacologiques régulant les effets délétères pro-inflammatoires de la réponse T helper au cours de la BPCO. / Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a chronic inflammatory disease characterized by irreversible damage to airways and alveolar spaces. Emphysema is the main component of COPD and exposure to tobacco smoke is the main etiological factor. The inflammatory response in COPD is characterized by a massive infiltration of respiratory tissue by inflammatory cells that secrete many proteases. These proteases participate in the degradation of extracellular matrix components and particularly in elastin degradation. This elastin breakdown leads to the genesis of soluble elastin peptides (EP) found in various biological fluids of COPD patients. If CD4+ T cells and EP are described in the literature as being involved in the pathophysiology of COPD, consequence of their interaction on the T helper polarization remains to elucidate. The work done during this thesis allowed highlighting the polarization of T cell response towards a Th1 and Th-17 profile during VGVAPG-induced murine emphysema. This polarization, which is dependent of the VGVAPG interaction with its specific receptor expressed on T cells, is inhibited using analogous antagonist elastin receptor peptides. These results allowed us to envisage such antagonist peptides as pharmacological agents that regulate the deleterious pro-inflammatory effects of the T helper cell response during COPD.

La Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) est une pathologie pulmonaire complexe entrainant une diminution progressive et irréversible des capacités respiratoires. L'emphysème est la composante majoritaire de la BPCO. Une importante réponse inflammatoire chronique est associée à la BPCO et implique à la fois les cellules de l'immunité innée, comme les macrophages et les polynucléaires neutrophiles (PN), et les cellules de l'immunité adaptative. La BPCO est également caractérisée par une destruction importante du tissu pulmonaire qui est associée à une dégradation de l'élastine et du collagène, deux protéines essentielles de la matrice extra-cellulaire (MEC). Cette dégradation génère des peptides doués de nombreuses activités biologiques. Le travail de thèse présenté ici nous a permis de montrer que l'injection intra-trachéale du peptide VGVAPG, une séquence active des peptides d'élastine (PE) induit un emphysème chez la souris, emphysème caractérisé par une forte infiltration des macrophages et des PN dans les lavages bronchoalvéolaires (LBA) et dans le parenchyme pulmonaire et par une destruction de la MEC au niveau du tissu pulmonaire. L'effet des PE s'exerce par le biais du complexe récepteur à l'élastine (CRE) et est déclenché par l'interaction des PE avec la sous-unité EBP du complexe. Nous avons montré, dans un travail précédent, que la spécificité de l'interaction entre l'EBP et les PE est associée à la présence du motif GXXP dans les peptides et à l'adoption d'une conformation en coude β de type VIII par le peptide. Sur la base de ces résultats, nous avons effectué, à partir du peptide VGVAPG, des mutations systématiques des résidus centraux de GXXP afin de déterminer les peptides les plus favorablement repliés en coude beta de type VIII et nous avons sélectionné les meilleurs candidats pour la fixation à l'EBP. Nous avons focalisé notre attention sur les peptides interagissant avec l'EBP et qui montraient des effets biologiques modérés. La possibilité d'utiliser de tels peptides comme des antagonistes des effets du peptide VGVAPG a été évaluée in vitro et in vivo. / The Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a complex lung disease causing a progressive and irreversible decrease in respiratory capacity. Emphysema is the major component of COPD. An important chronic inflammatory response is associated with COPD and involves both cells of innate immunity, such as macrophages and neutrophils (PN), and the cells of the adaptive immunity. COPD is characterized by extensive destruction of lung tissue that is associated with degradation of elastin and collagen, two essential proteins of the extracellular matrix (ECM). This degradation generates peptides endowed numerous biological activities. The thesis presented here has allowed us to show that the intratracheal injection of peptide VGVAPG, an active sequence of elastin peptides (PE)-induced emphysema in mice, emphysema characterized by a strong infiltration of macrophages and PN in the bronchoalveolar lavage (BAL) and in the lung parenchyma and the destruction of the ECM in the lung tissue. The effect of PE is exercised through the elastin receptor complex (CRE) and is triggered by the interaction of PE with subunit EBP complex. We have shown in previous work that the specificity of the interaction between EBP and PE is associated with the presence of GXXP motif in peptides and the adoption of a conformation type VIII β turn by peptide. Based on these results, we have made, from the peptide VGVAPG, systematic changes of the central residues GXXP to identify peptides most favorably bent type VIII β turn and we selected the best candidates for fixing to EBP. We focused our attention on the peptides interact with the EBP, which showed moderate biological effects. The possibility of using such peptides as antagonists of the effects of peptide VGVAPG was evaluated in vitro and in vivo.

La BPCO est une affection de l’appareil respiratoire associée à une réponse inflammatoire chronique. La BPCO associe une bronchite chronique, avec obstruction des voies aériennes, et un emphysème caractérisé par la destruction du parenchyme pulmonaire. Si l’exposition au tabac est le facteur de risque principal de la BPCO, plusieurs observations cliniques sont en faveur du rôle du vieillissement dans la pathogénèse de la maladie. La dégradation des fibres élastiques du poumon en peptides solubles d’élastine (PE) est une caractéristique constante de la BPCO, et le vieillissement physiologique du poumon est associé à une augmentation de son activité élastinolytique. Nous avons montré dans un travail précédent que l’instillation de PE à des souris induit un emphysème aigu. La relation existant entre l’élastolyse et le vieillissement conforte l’hypothèse que le vieillissement pourrait représenter un risque majeur de la BPCO par le biais de production de PE. Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit a porté sur l’étude comparative des paramètres histologiques, inflammatoires et immunitaires liés à l’emphysème induit par les PE dans des souris jeunes et des souris âgées. Les résultats obtenus montrent que l’emphysème est d’apparition plus précoce chez les souris âgées et que cette précocité s’accompagne d’une augmentation de la production de PE et de clones T CD28- mémoires spécifiques des PE et du processus d’immunosénescence. / Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a progressive and irreversible inflammatory state of the lung. COPD includes chronic bronchitis, with obstruction of small airways, and emphysema, characterized by the destruction of lung parenchyma. Although cigarette smoke exposure is the best known risk factor for COPD development, several clinical observations support the hypothesis that aging also play a key role in the pathogenesis of COPD. Degradation of lung elastin fibers, generating soluble elastin peptides (EP), is a feature of COPD development, and normal physiological aging of the lung is associated with increased elastolysis. We previously demonstrated in mice that endotracheal instillation of EP resulted in an acute emphysema establishment. The positive association between lung elastin breakdown and aging is consistent with the hypothesis that aging is a major risk factor of COPD through EP production. The work done during this thesis focused on the comparative study of histological, inflammatory and immune parameters related to PE-induced emphysema in young and elderly mice. The results we obtained show that emphysema development is earlier in the elderly mice and that this earliness is associated with an increase of EP-specific CD28- senescent memory T cell clones.

Longtemps considérée comme un simple support mécanique, la matrice extracellulaire (MEC) est un élément majeur dans le maintien de l’homéostasie. Ainsi l’élastine, principal constituant de la MEC des gros vaisseaux élastiques, est dégradée au cours du vieillissement, produisant ainsi des peptides d’élastine bioactifs (PE). Plusieurs études ont démontré l'implication des PE en physiopathologies tels que l’invasion tumorale, l’athérosclérose ou l’insulino-résistance (IRes). Ces effets s’expliquent par l’activation du complexe récepteur de l’élastine (CRE), composé par : une sous-unité extracellulaire liant les PE (EBP, elastin binding protein), la cathepsine A (dont le rôle reste inconnu), et la neuraminidase 1 (induisant la signalisation intracellulaire). L'IRes décrite, pourrait être associée à l’activité de désialylation de la neuraminidase-1 sur les chaines de N-glycosylation (Ng-c) du récepteur de l’insuline (RI). Sur la base de cette hypothèse, notre objectif a donc été de confirmer ce mécanisme et ses conséquences in silico (sur le RI), in vitro (pré-adipocytes 3T3-L1) et in vivo (aorte de souris). Nous montrons ainsi in vitro que les PE provoquent un dysfonctionnement de l’autophosphorylation du RI se répercutant sur plusieurs processus cellulaires comme l’entrée du glucose ou encore la différenciation adipocytaire. In silico, nous montrons pour la première fois le rôle des acides sialiques sur le comportement des Ng-c d'une part et sur le RI d'autre part. Enfin, in vivo, cette interaction CRE / IR engendre une hypertension artérielle par une diminution de la vasorelaxation des cellules endothéliales. / Often considered as a simple mechanical support, the extracellular matrix (ECM) is a major element of homeostasis regulation. Thus, elastin, the main constituent of large elastic vessels, is degraded during aging, producing bioactive elastin-derived-peptides (EDP). Several studies have demonstrated the EDP effects in physiopathologies such as tumor invasion, atherosclerosis, or insulin resistance (IRes) development. Those effects are explained by the activation of the elastin receptor complex (CRE), composed of: an extracellular subunit binding EDP (EBP, elastin binding protein), cathepsin A (its role is still unknown) and the sialidase neuraminidase-1 (Neu-1, involved in signaling pathway induction). Interestingly, the lab suggested that IRes may be induced by the desialylation of the N-glycan chains (Ng-c) on the insulin receptor (IR). The aim of this study was to confirm this hypothesis by demonstrating the consequence of desialylation on the IR in silico, on a 3T3-L1 pre-adipocyte cell in vitro, and on vascular complications in vivo. We show that EDP induce in vitro an impairment of IR autophosphorylation, affecting glucose uptake and adipocyte differentiation. In silico approach demonstrates the role of sialic acids on the behavior of Ng-c in the one hand and in other hand of IR. Finally, the IRes induced by ERC-IR interaction increase the vascular complication such as arterial hypertension by endothelial cell impairment. To conclude, Ng-c alteration would likely be responsible for structural changes in the IR at the origin of insulin resistance.

L'élastine est la protéine matricielle responsable de l'élasticité des tissus retrouvée dans des tissus soumis à de fortes contraintes mécaniques tels que les poumons, les artères ou la peau. La dégradation de cette protéine lors de processus physiopathologiques produit des peptides bologiquement actifs nommés peptides d'élastine portant le motif GXXPG essentiel à leur activité. Ces peptides régulent diverses fonctions biologiques telles que le chimiotactisme, la synthèse de protéases, la prolifération. Tous ces effets dépendent de la fixation des peptides d'élastine au complexe récepteur de l'élastine. Ce complexe est composé de trois sous-unités : une protéine périphérique de 67 kDa, l'Elastin Binding Protein (EBP), et deux protéines associées à la membrane, la Protective Protein/Cathepsin A (PP/CA) et la Neuraminidase-1 (Neu-1) de 55 et 61 kDa respectivement. L'activité sialidase de Neu-1 est responsable de l'activation de ERK 1/2 après fixation des peptides d'élastine au complexe récepteur de l'élastine.Dans cette étude, nous démontrons que l'EBP et les radeaux lipidiques sont colocalisés à la membrane plasmique. Nous montrons, de plus, que la déstructuration de ces microdomaines aussi bien que leur déplétion en glycolipides bloque la signalisation du récepteur. L'utilisation d'un anticorps monoclonal bloquant dirigé contre le GM3 montre qu'il est essentiel à la signalisation. Après traitement par les peptides d'élastine, le contenu cellulaire en GM3 diminue alors que celui en lactosylcéramide augmente suggérant une conversion du GM3 en lactosylcéramide. L'utilisation de lactose ou de siRNA Neu-1 bloque cette conversion ce qui tend à démontrer que le complexe récepteur de l'élastine est impliqué dans ce mécanisme. Une analyse par cytométrie en flux confirme cette production de lactosylcéramide induite par les peptides d'élastine.L'analyse par spectrométrie de masse mettrait en évidence deux lactosylcéramides (C23:0 et C24:1) potentiellement bioactifs dont la synthèse chimique a été entreprise. La purification des radeaux lipidiques par ultracentrifugation différentielle en gradient de saccharose ainsi que leur identification par Dot-blot couplé à la fluorescence montre un changement de densité de ces microdomaines après stimulation par les peptides d'élastine.L'évaluation biologique in vitro de ces lactosylcéramides montre qu'ils miment les effets des peptides d'élastine sur l'activation de ERK 1/2, la prolifération et la synthèse de MMP-1. Enfin, l'évaluation ex vivo des lactosylcéramides démontre une réduction de la zone de tissu cardiaque nécrosé suggérant un rôle cardioprotecteur de ces molécules. Ce travail propose un mécanisme original de transduction du signal à la membrane plasmique et nous laisse envisager le complexe récepteur de l'élastine, les peptides d'élastine et le lactosylcéramide comme de nouveaux agents thérapeutiques potentiels. / Elastin is the matrix protein responsible for the elasticity of tissues where resilience is required such as lung, arteries or skin. Elastin degradation during physiopathological processes produces biologically active peptides named elastin peptides bearing the GXXPG pattern essential for their activity. These peptides regulate various biological functions such as chemotaxis, proteases synthesis and proliferation. These effects are dependent of elastin peptide binding to the elastin receptor complex (ERC). This complex is composed of three subunits: a peripheral protein of 67 kDa called elastin binding protein (EBP) and two membrane-associated proteins, protective protein/cathepsin A (PP/CA) and neuraminidase-1 (Neu-1) of 55 and 61 kDa, respectively. The sialidase activity of Neu-1 is responsible for ERK 1/2 pathway activation following binding of elastin peptide on the elastin receptor complex.In this study, we demonstrate that EBP and lipid rafts colocalize at the plasma membrane. We also show that the disruption of these microdomains and their depletion in glycolipids block the receptor signaling. The use of a monoclonal anti-GM3 blocking antibody shows that this glycosphingolipid is essential for signaling. Following elastin peptide treatment, cellular GM3 level decreases while the lactosylceramide one increases consistently with a GM3/LacCer conversion. The use of lactose or Neu-1 siRNA blocks this process suggesting that the elastin receptor complex is involved in this mechanism. Flow cytometry analysis confirms this elastin peptide-driven LacCer generation.Mass spectrometry analysis of elastin peptide-stimulated cell membrane extracts identified two potentially bioactive lactosylceramides (C23:0 and C24:1) and their synthesis has been realized. Lipid rafts purification by differencial ultracentrifugation in sucrose gradient shows a variation of the microdomains density as well as their identification by fluorescence linked-Dot-blot following elastin peptide stimulation.In vitro biological evaluation of these lactosylceramides shows that they mimic the elastin peptide effects on ERK 1/2 activation, proliferation and MMP-1 synthesis. Finally, ex vivo lactosylceramides evaluation demonstrates a decrease of cardiac tissue necrosis area suggesting that these molecules could be cardioprotective agents. This work proposes an original mechanism of signal transduction at the plasma membrane and let us foresees the elastin receptor complex, elastin peptides and lactosylceramide as new potential therapeutical targets.