Les synthétases non ribosomiales sont des complexes multienzymatiques qui synthétisent des peptides atypiques par un mécanisme de thiotemplate indépendant des ribosomes. Ces peptides possèdent un large spectre d’activités biologiques et sont utilisés dans les domaines de la médecine et de la recherche biologique. Leur application dans d’autres domaines comme l’agriculture et l’environnement est de plus en plus envisagée à cause des fonctions diverses et de leur innocuité par rapport aux analogues chimiques. Plusieurs bactéries (levures et champignons) posséderaient la capacité de synthétiser ces molécules particulières.Nos travaux se sont concentrés sur la mise au point d’une nouvelle approche moléculaire de criblage par la réaction de polymérisation en chaîne, dans le but de détecter des souches de Lactobacillus et de Bacillus capables de produire ces peptides particuliers. Ainsi, plusieurs couples d’amorces dégénérées spécifiques (As1-F/Ts2-R, Am1-F/Tm1-R, Af2-F/Tf1-R, Ap1-F/Tp1-R) ont été définis à partir des gènes connus de synthétases impliquées dans la biosynthèse de ces molécules. Ces amorces ont permis de révéler le potentiel de synthèse de molécules non ribosomiales de Bacillus cereus LMG 2098 et de Bacillus thuringiensis serovar berliner 1915puis ont confirmé la présence de gènes NRPS dans d’autres bacilles déjà connus pour leur synthèse. La combinaison de ce criblage moléculaire avec les analyses biochimiques classiques a permis de montrer que la kurstakine présente chez B. thuringiensis serovar berliner 1915 est synthétisée par voie non ribosomiale / Non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) are multimodular enzymes that make atypical peptides through a thiotemplate mechanism independent of ribosomes. These peptides have a broad spectrum of biological activities. Since several ten years, they are used in the fields of medicine and the biological research. They also have a lot of potential applications in the agricultural and environmental fields. Several bacteria would have the capacity to synthesize these particular molecules. To detect Lactobacillus and Bacillus strains able to produce these peptides, a new Polymerase Chain Reaction screening approach was developed using degenerated primers based on the intra-operon alignment of adenylation and thiolation nucleic acid domains of enzymes implicated in the biosynthesis of these peptides.This work led to the discovery of the presence of many non-ribosomal peptides in Bacillus strains, particular kurstakins in Bacillus thuringiensis serovar berliner 1915.

Les peptides non-ribosomiaux sont des molécules produites par les micro-organismes et présentant un large éventail d’activités biologiques et pharmaceutiques. Par exemple, ils peuvent présenter des activités antibiotiques, immuno-modulatrices ou anti-tumorales. Ces peptides sont synthétisés par de grands complexes multi-enzymatiques, appelés synthétases ou NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetases). Deux traits caractéristiques distinguent ces peptides des peptides ribosomiaux classiques : le premier est que leur structure primaire n’est pas toujours linéaire mais peut être totalement ou partiellement cyclique, branchée voir même poly-cyclique, et le second est la diversité des monomères incorporés au sein de ces peptides qui dépasse largement les vingt acides aminés protéogéniques. Nous avons développé Norine, la première ressource publique entièement dédiée aux peptides nonribosomiaux. Norine contient actuellement plus de 1 000 peptides, modélisés par des graphes étiquetés non-orientés, ainsi que des outils informatiques permettant leur analyse, comme la comparaison de compositions en monomères, la recherche de motifs structuraux ou la recherche par similarité. Des analyses statistiques sur les données contenues dans Norine ont permis de mettre en évidence des caractéristiques biologiques intéressantes comme la spécificité des monomères en fonction de l’activité biologique qui nous a conduit à l’élaboration d’un outil d’aide à la prédiction de la fonction biologique d’un peptide à partir de sa composition monomérique. En trois ans, Norine est devenue la ressource internationale pour les peptides non-ribosomiaux. / Nonribosomal peptides are molecules produced by microorganisms and displaying a broad spectrum of biological activities and pharmaceutical applications. They can harbor anti-microbial, immunomodulating or anti-tumor activities. These peptides are synthesized by huge multi-enzymatic complexes, called NonRibosomal Peptide Synthetases. Two main structural traits distinguish these peptides from the ribosomally synthesized ones : first, their primary structure is not always linear but is often cyclic (partially or totally), branched or poly-cyclic, and second, the diversity of monomers incorporated into nonribosomal peptides extends far beyond the 20 proteogenic amino acids residues. We have developed Norine, the first public resource entirely dedicated to nonribosomal peptides. Norine currently contains more than 1 000 peptides, modeled by non-oriented labeled graphs, and computational tools allowing their analysis, such as monomer composition comparison, structural pattern matching or similarity search. Statistical analysis of Norine data highlighted interesting biological properties such as a specific monomer composition depending on the biological activity, that led us to develop a tool for helping the prediction of peptide activity from its monomeric composition. In three years, Norine became the international resource for nonribosomal peptides.

Cette thèse a porté sur l’étude de la biosynthèse d’un lipopeptide antifongique, la mycosubtiline, produit par Bacillus subtilis ATCC6633 sous la forme d’un mélange d’isoformes qui varient selon la longueur et l’isomérie de leur chaine d’acide gras. La nature de l’acide gras influence l’activité biologique du lipopeptide. La corrélation entre la synthèse des isoformes de mycosubtiline et d’acides gras cellulaires a été étudiée en faisant varier des conditions de culture telles que l’osmolarité, la température et la source d’azote. Les variations du profil d’acides gras influencent dans la majorité des cas le profil des mycosubtilines obtenues confirmant le rôle important de ces précurseurs pour la synthèse du lipopeptide. Les effets de la modification génétique de deux gènes intervenant dans la synthèse de ces précurseurs ont été également caractérisés. La surexpression du gène ilvA codant pour la thréonine déshydratase et intervenant donc dans la synthèse de l’isoleucine augmente la synthèse de la mycosubtiline anteisoC17 alors que l’interruption d’un gène régulateur pléiotropique codY favorise la formation de la forme isoC16. Une souche monoproductrice constitutive de mycosubtiline, obtenue par optimisation génétique de la souche ATCC 6633 a également été caractérisée. Enfin, une première approche de purification des synthétases impliquées dans la synthèse de la mycosubtiline a été réalisée. Ces études ont contribuées à une meilleure compréhension des paramètres influençant « in vivo » cette synthèse, ainsi qu’à l’amélioration de la production de mycosubtiline, et à la définition des conditions optimales d’obtention des isoformes les plus actives. / This thesis is about the study of an antifungal lipopeptide , the mycosubtilin produced by Bacillus subtilis ATCC 6633 as a co-production of isoforms which vary according to the length and the isomery of the fatty acids chain (mostly nC16, isoC16, nC17, isoC17 and anteisoC17). The nature of fatty acid chain influences the biological activity of the lipopeptide. The relationship between the mycosubtilin isoforms synthesis and the fatty acids synthesis was studied by the variation of growth parameters like osmolarity, temperature and nitrogen source. The important role of fatty acids precursors for the lipopeptides synthesis was confirmed by the influence of fatty acids pattern variations on the mycosubtilines pattern. The effects of genetic modification of two genes involved in synthesis of fatty acids precursors were also characterized. The overexpression of ilA coding for threonine deshydratase, involved in isoleucine synthesis increase the mycosubtilin anteisoC17 production while the knock-out of the pleitropic regulator gene codY improves the isoC16 mycosubtilin synthesis. Moreover, a mycosubtilin constitutive monoproductive strain, obtained by genetic optimization of ATCC 6633 strain was also characterized. Then, a preliminary purification approach of synthetases implied in mycosubtilin synthesis was realized. Those studies contribute to a better understanding of parameters influencing in vivo synthesis as well as the improvement of mycosubtilin production and the definition of optimal conditions to obtain the most active isoforms.

La synthèse peptidique non ribosomiale est réalisée par de grands complexes multienzymatiques, appelés synthétases, qui permettent la synthèse de peptide par une voie indépendante de l’intervention des ribosomes. Les peptides produits par cette voie de synthèse (NRPs) sont largement étudiés et divers outils d’analyse bioinformatique qui permettent la prédiction de la structure d’une synthétase ainsi que de la composition de son produit, sont disponibles. Ce type de synthèse peptidique a été décrit chez plusieurs microorganismes. Notre choix de modèle d’étude s’est porté sur les Pseudomonas fluorescents producteurs de deux types de NRPs, les lipopeptides cycliques (CLPs) et des sidérophores dont le plus représenté est la pyoverdine. L’étude de ces NRPs a été entreprise par des études expérimentales et bioinformatiques. Ces travaux ont permis de montrer le potentiel de synthèse non ribosomiale par une étude bioinformatique des 20 génomes de Pseudomonas disponibles. L’étude des synthétases de pyoverdine et l’extraction des signatures des domaines d’adénylation (A) ont permis d’améliorer la prédiction issue des outils d’analyse disponibles. Des expériences de feeding suivies par spectrométrie de masse MALDI-TOF ont permis de mettre en évidence des domaines A permissifs au sein des synthétases de pyoverdines. / The non-ribosomal peptide synthesis is performed by large multienzymatic complexes, called synthetases, which allow the synthesis of a peptide by a way independent of the intervention of the ribosomes. The peptides produced by this synthetic way (NRPS) are widely studied and various bioinformatics analysis tools that allow the prediction of the structure of the synthetase and the composition of his product, are available. This kind of peptide synthesis has been described in several microorganisms. Our choice focus on the fluorescent pseudomonads producing two types of NRPS, the cyclic lipopeptides (CLPS) and siderophores, the most represented is the pyoverdin. The study of these NRPS was performed by experimental and bioinformatics analysis. This work has demonstrated the potential of non-ribosomal synthesis by a bioinformatics study of the 20 avalaible genomes of Pseudomonas. Study of pyoverdine synthetases and extracting signatures of adenylation domains (A) have allowed to improving the prediction of the avalaible tools. Feeding experiments followed by MALDI-TOF helped to highlight permissive A domains in pyoverdins synthetases.

Les peptides non-ribosomiaux sont des molécules produites par les micro-organismes et présentant un large éventail d'activités biologiques et pharmaceutiques. Par exemple, ils peuvent présenter des activités antibiotiques, immuno-modulatrices ou anti-tumorales. Ces peptides sont synthétisés par de grands complexes multi-enzymatiques, appelés synthétases ou NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetases). Deux traits caractéristiques distinguent ces peptides des peptides ribosomiaux classiques : le premier est que leur structure primaire n'est pas toujours linéaire mais peut être totalement ou partiellement cyclique, branchée voir même poly-cyclique, et le second est la diversité des monomères incorporés au sein de ces peptides qui dépasse largement les vingt acides aminés protéogéniques. Nous avons développé Norine, la première ressource publique entièement dédiée aux peptides nonribosomiaux. Norine contient actuellement plus de 1 000 peptides, modélisés par des graphes étiquetés non-orientés, ainsi que des outils informatiques permettant leur analyse, comme la comparaison de compositions en monomères, la recherche de motifs structuraux ou la recherche par similarité. Des analyses statistiques sur les données contenues dans Norine ont permis de mettre en évidence des caractéristiques biologiques intéressantes comme la spécificité des monomères en fonction de l'activité biologique qui nous a conduit à l'élaboration d'un outil d'aide à la prédiction de la fonction biologique d'un peptide à partir de sa composition monomérique. En trois ans, Norine est devenue la ressource internationale pour les peptides non-ribosomiaux.