Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El pez dorado S. lalandi, es una especie marina pelágica, que posee características favorables para su producción intensiva, tales como altas tasas de crecimiento y de conversión alimenticia, resistencia a las altas densidades de los cultivos, docilidad y demanda internacional creciente (Poortenaar et al., 2001). Sin embargo, en su acuicultura se ha observado una baja sobrevivencia en las etapas de hatchery, la que se atribuiría principalmente a la producción de huevos y embriones de baja calidad (Carnevali et al., 2001). Una de las principales causas de esta deficiencia, sería una deficiente acumulación y procesamiento del vitelo durante la ovogénesis y el desarrollo embrionario temprano. Se ha visto, que las catepsinas B, D y L son las principales enzimas lisosomales involucradas en la proteólisis del vitelo en los vertebrados ovíparos (Carnevali et al., 2006). La expresión de estas enzimas, así como su actividad durante la ovogénesis y la embriogénesis, parecen ser especie-específicas, desconociéndose estos antecedentes en miembros del género Seriola. En este trabajo, se evaluó la expresión de las catepsinas B, D y L durante diferentes etapas del desarrollo embrionario temprano de S. lalandi (E1: huevos recién fecundados, E2: 4 células, E3: 16 células, E4: bástula, E5: 24 HPF y E6: 48 HPF). Se utilizó la técnica RT-qPCR y como estrategia de cuantificación, la normalización de la expresión con los genes constitutivos Tubulina (TUB) y -actina (ACTB), los cuales se validaron como referencia entre seis genes constitutivos candidatos. Las tres catepsinas se expresaron durante los distintos estadíos, presentando un nivel de expresión alto en los primeros estadíos, representando probablemente los niveles de transcritos maternos. Luego, durante la blastulación donde ocurre la MBT, hubo una disminución brusca de la expresión. Posteriormente, la expresión presentó una disminución en catepsina B, no así para catepsina D y L, que aumentaron sus niveles de expresión indicando la expresión cigótica de estas enzimas. Estos resultados concuerdan con la función de estas proteasas en generar las condiciones osmóticas necesarias para la hidratación final del ovocito y además, proveer al embrión de energía durante su periodo de alimentación endógena, a través de los aminoácidos libres generados de la proteólisis del vitelo / Financiamiento: Proyecto Fondecyt Postdoctorado 3120211 y PDACH Área Genética

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La mortalidad embrionaria que se ha observado en condiciones de cultivo del pez dorado Seriola lalandi, puede ser mencionada entre los principales obstáculos que han frenado el desarrollo acuícola de esta especie en nuestro país. Esta mortalidad se relaciona a la pérdida de flotabilidad de los huevos y embriones tempranos, la cual se debería a la participación del mecanismo de apoptosis celular. Estudios previos demostraron una mayor expresión de moléculas que participan en la vía intrínseca de este proceso, en huevos y embriones de S. lalandi con bajo nivel de flotabilidad. Por lo tanto, en este trabajo se propuso determinar si en esta pérdida de flotabilidad participan también moléculas de la vía extrínseca, como el sistema Fas/FasL y Caspasa 8. Para esto, se evaluó mediante la técnica de Western Blot la expresión de las proteínas Fas y Fas-L y mediante RT-qPCR la expresión del ARNm de Caspasa 8 en embriones tempranos de S. lalandi clasificados como flotantes y no flotantes. La proteína Fas se expresó como una banda de 50 kDa en todos los estadios en las muestras flotantes. Sin embargo, en los no flotantes este receptor se detectó en tres bandas reactivas de 40, 50 y 65 kDa. FasL (44 kDa) sólo fue detectado en embriones flotantes de 24 horas, mientras que en las muestras no flotantes este ligando se detectó en todos los estadios con un aumento (p<0,05) en su expresión, en la medida que avanzó el desarrollo. Por otro lado, los mayores niveles (p<0,05) de ARNm de Caspasa 8 se observaron en embriones de 24 horas en las muestras flotantes y a partir del estado de gástrula en los no flotantes. Además, la expresión de Caspasa 8 fue mayor (p<0,05) en las muestras no flotantes, en comparación con las flotantes en todos los estadios del desarrollo. Estos resultados, confirman la presencia de moléculas de la vía extrínseca de la apoptosis en huevos y embriones tempranos de S. lalandi, con perfiles de expresión en las muestras no flotantes que representarían un estado pre-apoptótico de estas muestras. Sin embargo, se requieren estudios especie-específicos y complementarios para entender principalmente, la naturaleza del agente inductor de la activación de esta vía. Finalmente, se asume que existió una viabilidad funcional comparable entre las muestras flotantes y no flotantes en todos los estadios del desarrollo analizados, debido a que no se encontraron diferencias (p<0,05) en los valores promedio de Ct, entre estas muestras, de cuatro genes constitutivos (ACTB, 18S, GAPDH y MAP1β). / The embryonic mortality observed under captivity in the yelow-tail kingfish Seriola lalandi could be mentioned among the main obstacles that have avoided its aquaculture development in our country. This mortality has been related to low buoyancy of eggs and early embryos, which would be due to the participation of the apoptosis mechanism. Previous results in S. lalandi have demonstrated greater expression of apoptosis intrinsic pathway molecules in eggs and embryos with low buoyancy level. Therefore, this work aimed in to determine if molecules of the extrinsic pathway such as Fas/FasL system and Caspase 8 are involved in the buoyancy losing. For this, Fas/FasL system and Caspase 8 expression were evaluated in early embryos of S. lalandi previously classified as floating and non-floating, by Western Blot and RT-qPCR, respectively. Fas protein was expressed as a 50 kDa band in all floating developmental stages. However, in non-floating this receptor was detected in three reactive bands of 40, 50 and 65 kDa. FasL (44 kDa) was only detected in 24-hour floating embryos, whereas in the non-floating samples this ligand was detected in all stages with an increase (p<0,05) in its expression as development progressed. By other hand, the highest levels (p<0,05) of Caspase 8 mRNA were observed in 24 hours embryos in floating samples and from gastrula stage in the non-floating ones. In addition, Caspase 8 expression was higher (p<0,05) in non-floating than floating samples, in all developmental stages. These results confirm the presence of apoptosis extrinsic pathway molecules in eggs and early embryos of S. lalandi, which show expression profiles in the non-floating samples that could be interpreted as apoptotic pre-activation. However, species-specific studies are required to understand the nature of the apoptotic pathway trigger. Finally, a comparable viability between floating and non-floating samples used in this study could be assumed since no differences (p<0,05) in Ct value of constitutive genes (ACTB, 18S, GAPDH and MAP1 β) were detected these samples. / Proyecto Fondecyt 11140639.