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Caractérisation d'une nouvelle voie de biogenèse des petits ARN / Characterisation of a new small RNA biogenesis pathwayHallais, Marie 17 November 2010 (has links)
Les mécanismes régissant le trafic et la localisation des ARN à l'intérieur du noyau sont encore mal compris. La protéine PHAX (Phosphorylated adaptator for RNA export) est un facteur nécessaire à l'export nucléaire des précurseurs des snARN, ainsi qu'à l'adressage des précurseur des snoRNA coiffés vers les corps de Cajal (Ohno et al., 2000 ; Boulon et al., 2004 ). De manière remarquable, la liaison de PHAX à ces ARN est strictement dépendante de leur taille, et celle-ci est perdue au-delà d'une certaine longueur d'ARN (Ohno et al., 2002). Cependant, in vitro, PHAX est capable de s'associer aux ARN, mais il le fait sans spécificité de séquence ni de taille. L'étude des mécanismes impliqués dans la distinction des petits ARN non-codants des grands ARN comme les ARN messagers, est malgré tout essentielle car elle dirige ces ARN vers des voies de maturation différentes. Lors de ma thèse j'ai mis en place un projet qui aborde deux questions : (i) déterminer comment le facteur PHAX sélectionne les petits ARN, (ii) caractériser l'ensemble des ARN liés à PHAX dans le but de découvrir de nouveaux petits ARN non-codants. J'ai observé que PHAX forme un complexe avec le CBC, comme attendu, et avec une protéine non caractérisée à l'époque, et que nous avons nommée PBP1 (PHAX binding protein 1). J'ai pu déterminer que ces quatre protéines, CBC20-CBC80-PHAX-PBP1 forment un complexe, que j'ai appelé complexe CBCAP. In vivo, ce complexe est bien associé avec les précurseurs de snARN et snoARN. De façon très intéressante, le complexe CBCAP est aussi associé à de nombreux ARNs messagers de petite taille (inferieurs à 1500pb). De manière intéressante, les ARN liés par le CBCAP sont également parmi les plus abondants dans la cellule. L'expression de ces ARN est de plus affectée suite à la déplétion des protéines PHAX ou PBP1, et, de manière surprenante, ces protéines ont souvent des effets opposés sur la stabilité de ces ARN. PHAX est préférentiellement requis pour la production des snRNA, tandis que PBP1 est plutôt nécessaire à la production des snoRNA coiffés et des ARN messagers. Le complexe CBCAP pourrait donc sélectionner les ARN selon leur taille et il distinguerait plusieurs types d'ARN (codants ou non-codants; exportés ou retenus), af in qu'ils soient orientés vers la voie de maturation adéquate. De manière remarquable, la production de PBP1 est elle-même contrôlée par des signaux de croissance cellulaire. Ainsi, PBP1 permettrait de réguler l'expression des ARN les plus abondants dans la cellule, et jouerait ainsi un rôle clef dans le contrôle de la croissance cellulaire. Au cours de ma thèse, j'ai aussi observé par analyse tilling array, la co-précipitation avec PBP1 et de PHAX avec des petits ARN non annotés. J'initie la caractérisation de ces nouveaux ARN. / RNA localisation determines the fate of RNA. However inherent transport mechanisms still remain unclear. The protein PHAX is required for snRNA and snoRNA maturation as it both exports precursors of snRNA to the cytoplasm via the recruitment of the CRM1 export machinery, and transports precursors of capped snoRNA to the cajal bodies. Interestingly, PHAX associates with and transports mainly small RNA through a mechanism that is not specific of the RNA sequence. To determine how PHAX recognises specifically small RNA, we characterised the PHAX native complex. We purified a complex that we called CBCAP, which contains the CBC (cap binding complex), the protein that we called PBP1 (PHAX binding protein 1) and the transporter PHAX. As expected, this complex is associated with precursors of snRNA and snoRNA. Interestingly, we also co-purified with CBCAP small coding RNA (under 1500bp). Furthermore, expression of these RNA is affected by PBP1 and PHA X depletion. Surprisingly, these two proteins have an opposite effect on RNA stability. PHAX is required for snRNA expression, whereas PBP1 seems to control capped snoRNA and small mRNA expression. The complex CBCAP might thus be involved in the distinction of RNA size and seems to discriminate coding from non-coding RNA in order to address them to the appropriate processing pathway.
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U snRNAの核外輸送複合体の形成に関与する因子の解析和泉, 光人 24 March 2014 (has links)
京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第18114号 / 理博第3992号 / 新制||理||1576(附属図書館) / 30972 / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 大野 睦人, 教授 青山 卓史, 教授 高田 彰二 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DFAM
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Investigating the role of extended CBC complexes in RNA metabolism / Etude du complexe CBC et ses différents rôles dans la biogenèse des ARNBenbahouche, Nour el Houda 10 December 2015 (has links)
Le CBC intervient dans de nombreuses étapes du métabolisme des ARN, telle que l’épissage, la maturation de l’extrémité 3’, la dégradation, l’export et la traduction. Ainsi, le CBC constitue un complexe majeur qui peut orchestrer les différentes étapes de maturation des ARN. Récemment, nous avons identifié le complexe CBCAP, composé de CBC, ARS2 et PHAX. Nous avons montré que la protéine ARS2 stimule la formation des extrémités 3’ de plusieurs familles d’ARN dont les snARN. De plus, ARS2 stimule le recrutement de PHAX sur le CBC. Ainsi, nous proposons un modèle où CBC-ARS2 stimule la formation de l’extrémité 3’ des pré-snARN et recrute PHAX pour favoriser leur export. Une autre étude a identifié un autre complexe le CBCN, constitué de CBC, Ars2, et de ZC3H18-NEXT au lieu de PHAX. CBCN recrute l’exosome et stimule la dégradation de certains ARN, comme les PROMPTS et les transcrits «read-through » des snARN et des ARNm d’histone. Ainsi, PHAX et ZC3H18 destinent leur ARN cibles vers l’export ou la dégradation. Il a été montré que PHAX reconnait et lie spécialement les ARN de petite taille. D’une manière remarquable, nos données de CLIP-Seq et de RIP suivie par des analyses avec des puces « All genes » montrent que PHAX lie aussi d’autres familles d’ARN. En effet, PHAX lie les ARNm ainsi que des ARN non-codant avec une légère préférence pour les snARN (en comparaison avec ZC3H18). Afin de mieux comprendre le rôle de PHAX et ZC3H18, j’ai tout d’abord démontré si les deux protéines se lient simultanément au CBC. Pour ce faire, J’ai réalisé des tests de compétitions entre PHAX et ZC3H18, in vivo, et j’ai montré que la surexpression de ZC3H18 déplace PHAX du CBC et vice versa. Puis en utilisant la technique de « Tethering Assays » j’ai pu montrer que PHAX et ZC3H18 ont des effets opposés sur la biogénèse des ARNm. De plus PHAX semble avoir un effet positif sur la maturation des ARNm et ce, en empêchant ZC3H18 et l’exosome d’être recruter. Nous avons aussi montré que la déplétion de PHAX et ZC3H18 a des conséquences fonctionnelles sur le taux des formes matures des snARN. Dans le but de caractériser la protéine ZC3H18, j’ai réalisé un crible double-hybride et j’ai montré que ZC3H18 interagit avec plusieurs facteurs d’épissage. J’ai aussi identifié les domaines de ZC3H18 impliqués dans ses différentes interactions. D’une manière intéressante, l’interaction de ZC3H18 avec certains facteurs d’épissage peut être exclusive à son interaction avec NEXT. De plus, des expériences de protéomique réalisés sur un des facteurs d’épissage trouvé dans le crible, montrent qu’il co-purifie au sein d’un complexe qui pourrait faire le lien entre la coiffe et la machinerie d’épissage. En accord avec ces résultats, nos données de RNA-seq montrent que la déplétion de ZC3H18 engendre un défaut d’épissage pour des introns qui sont proches de la coiffe et ceci pour un nombre restreint de gènes. Ainsi, notre travail décode davantage le rôle de la coiffe dans les différentes étapes de maturation des ARN et suggère un modèle où la séquence des transcrits naissant stimule la formation d’un complexe spécifique à cet ARN parmi plusieurs autres. / The cap binding complex (CBC) plays a key role in a number of gene expression pathways and has been proposed to participate in the discrimination of RNA families. It also enhances many RNA processing steps, including transcription, splicing, 3’end formation, degradation, export and translation.Recently, we identified the CBCAP complex, composed of CBC, Ars2 and PHAX. We showed that Ars2 stimulates snRNA 3'-end processing as well as PHAX binding to the CBC, hence coupling snRNA maturation with their export. Other studies showed that the CBC and ARS2 can form another complex that contains ZC3H18-NEXT instead of PHAX. This complex, named CBCN, is a cofactor of the RNA exosome and is involved in the degradation of cryptic RNAs such as PROMPTs and read-through transcripts at histone and snRNA genes. Thus, PHAX and ZC3H18 target specific families of capped RNA toward either export or degradation. Previous studies proposed that PHAX binds specifically to small RNAs and discriminates them over other RNA species. Surprisingly, our CLIP-Seq and RIP-microarrays data showed that in contrast to expectations, PHAX was not specific for snRNAs. It also binds mRNAs as well as other non-coding RNAs and has a weak preference for snRNAs comparing to ZC3H18. To better understand the role of PHAX and ZC3H18, Ifirst determined whether PHAX and ZC3H18 can bind simultaneously to the CBC. Competitive LUMIER IPs indicated that binding of these proteins is mutually exclusive. I then used tethering assays and could show that PHAX and ZC3H18 have opposite effect on mRNA biogenesis. These data go against a model where binding of PHAX or ZC3H18 discriminate RNA families, and instead suggest promiscuous binding for these proteins. In addition, PHAX may exert a positive effect on mRNA processing by preventing binding of ZC3H18 and recruitment of the RNA exosome. Last but not least, our RT-QPCR data show that PHAX and ZC3H18 depletions have functional consequences on the level of mature snRNA, and this is due to a competition between both proteins which occur on those snRNA read-through transcripts.To further explore the role of ZC3H18, I performed a two-hybrid screen and identified several splicing factors. I could validate these interactions, identify the domains involved and show that binding of some of these factors is exclusive with that of NEXT. Importantly, proteomic experiments with one of these factors identified a complex that makes the link between the cap and the splicing machinery. In agreement, RNA-Seq analysis of ZC3H18 knock-down cells showed alterations in splicing of cap-proximal introns, for a small set of genes.Altogether, this work reveals how the multiple roles of the RNA cap are achieved at the biochemical level, and suggests that the nascent RNA sequence triggers formation of one among several mutually exclusive complexes.
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