A novel molecular mechanism of autophosphorylation-dependent activation of the ser/thr S6/H4 kinase isolated from human placenta is described. Phosphopeptide mapping of the enzyme was used to determine the rate and extent of site-specific autophosphorylation. These data were correlated to phosphotransferase activity of the protein kinase. The results indicated that a sequential phosphorylation of two sites in the catalytic domain is required for maximum activation. Kinetic analysis determined that site 1 is modified by an intramolecular phosphorylation, and site 2 is modified by an intermolecular phosphorylation. On the basis of these data a model is proposed in which autophosphorylation of the pseudosubstrate domain and on a serine residue in subdomain VIII are both required for maximum activation of the S6/H4 kinase.

L'inflammation est un processus déclenché suite à la détection de pathogènes et de dommages tissulaires. Elle conduit à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les cellules immunitaires innées ainsi qu'au déclenchement de la pyroptose, mort cellulaire pro-inflammatoire. NLRP3 est une protéine senseur de stress cellulaire régulant le déclenchement de ces processus via la formation d'une plateforme multiprotéique appelée inflammasome. L'activation non contrôllée de NLRP3 conduit au développement d'une maladie auto-inflammatoire appelée CAPS (Cryopyrin associated periodic syndrome). De plus, l'inflammasome est impliqué dans le développement et la sévérité des symptômes de nombreuses maladies multifactorielles (diabète de type 2, athérosclérose, maladie de Parkinson et d'Alzheimer, sclérose en plaques, cancers...). Les mécanismes régulant l'activation de NLRP3 ne sont pas encore compris, mais les modifications post-traductionnelles de NLRP3 sont impliquées dans ce processus. Notre laboratoire a identifié différents sites d'ubiquitination et de phosphorylation sur NLRP3 par des approches biochimiques. Via la création de lignées cellulaires NLRP3 knock out reconstituées pour exprimer NLRP3 muté sur les résidus précédemment identifiés et de souris NLRP3 knock-in par la technique de CRISPR/Cas9, le travail de thèse a consisté en l'étude de l'impact fonctionnel de ces modifications. Ces résultats montrent que les substitutions de deux lysines identifiées comme étant ubiquitinées conduisent à une dérégulation de l’activation de l'inflammasome NLRP3 dans les cellules primaires. Un nouveau point de contrôle de l'activation de NLRP3 a ainsi pu être mis en lumière. / Inflammation is triggered after the sensing of pathogens or tissue damages. This process leads to the secretion of pro-inflammatory cytokines by innate immune cells and to the triggering of a pro-inflammatory form of cell death called pyroptosis. NLRP3 protein is a sensor of cellular stress and regulates the triggering of these events through the formation of a multiproteic platform called inflammasome. NLRP3 activation has to be tightly controlled as its deregulation leads to the development of an auto-inflammatory disease called CAPS (Cryopyrin associated periodic syndrome). Moreover, NLRP3 inflammasome is associated with the development and the severity of numerous multifactorial diseases (type 2 diabetes, atherosclerosis, Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease, multiple sclerosis, cancers…). The mechanisms involved in the regulation of NLRP3 activation are not fully understood. Recently, post-translational modifications of NLRP3 were shown to be important for the regulation of NLRP3 activation. Our lab has identified several phosphorylation and ubiquitination sites on this protein through biochemical studies. This phD work aims to identify the functional impact of these modifications. Thus, the generation of reconstituted cell lines expressing NLRP3 mutated on the previously identified residues and the generation of NLRP3 knock in mice via CRISPR/Cas9 technology were performed. The results show that substitution of two lysine residues previously identified as ubiquitinated leads to the deregulation of NLRP3 inflammasome activation in primary cells. This work highlights a new point of control in NLRP3 activation.

Les arrestines sont connues pour leurs rôles dans la désensibilisation et l'endocytose des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Au fil des ans, plusieurs partenaires de ces protéines adaptatrices ont été identifiés, notamment diverses molécules impliquées dans la signalisation, incluant les kinases ERK, JNK, Akt, Raf et Src. Ainsi, les arrestines interagissent avec plusieurs kinases, mais seulement avec deux phosphatases, PPA2 et MKP7. Récemment, notre laboratoire a démontré une nouvelle interaction entre les arrestines non-visuelles et la phosphatase Shp2. En effet, des essais in vitro et in cellulo ont montré une interaction directe entre les deux protéines peuvent interagir ensembles et ce directement. Or, nous en sommes venus à nous demander si les arrestines peuvent être phosphorylées sur leurs résidus tyrosine et si cette modification pourrait être régulée par des partenaires connus, soient Src et Shp2. Il a déjà été montré que l'arrestine 2 peut être phosphorylée sur un résidu tyrosine qui lui est unique et que cette modification expliquerait peut-être les différences de modulation entre les arrestines non-visuelles. Par contre, il n'existe encore aucune preuve que l'arrestine 3 puisse aussi être phosphorylée. D'abord, nous démontrons pour la première fois que l'arrestine 3, tout comme l'arrestine 2, est phosphorylée sur des résidus tyrosines et que cette modification peut être amenée par l'activité de Src. Ensuite, un double mutant ponctuel de l'arrestine 3 a été construit afin de cibler les tyrosines régulées. Il semble que les tyrosines 380 et 404 de l'arrestine 3, soient d'importants sites de phosphorylation. Ce nouveau mutant de l'arrestine 3 représente un excellent outil afin de déterminer le rôle de la phosphorylation des tyrosines de l'arrestine 3. Aussi, puisque ces deux tyrosines sont absentes de la séquence de l'arrestine 2, leur phosphorylation pourrait être à la base des différences fonctionnelles entre les arrestines 2 et 3. De plus, nous faisons la démonstration, en conditions de surexpression en cellules, que l'activité de Shp2 peut mener à la déphosphorylation des arrestines non-visuelles. Dès lors, nos études montrent d'abord que, tout comme son homologue, l'arrestine 3 peut être phosphorylée sur ses tyrosines. De plus, cette phosphorylation est non seulement régulée par la phosphatase Shp2, mais représente également un nouveau mécanisme potentiel de régulation des multiples fonctions des arrestines.

NOTCH1 est un récepteur transmembranaire qui, suite à la liaison de son ligand, subit une série de clivages protéolytiques libérant un fragment intracellulaire actif NIC1. Une fois libéré, NIC1 transloque au noyau où il s’associe à des cofacteurs transcriptionnels tels CSL et MAML1 afin d’initier la transcription de gènes cibles dont HES1. La voie Notch joue un rôle dans différents processus cellulaires, dont la prolifération, la mort cellulaire et la différenciation cellulaire. En conséquence, une mauvaise régulation ou une perte d’activité de cette voie de signalisation mène à des maladies humaines telles que des pathologies du développement et le cancer. De ce fait, la voie Notch est grandement régulée à divers niveaux. Entre autres, NIC1 subit des modifications post-traductionnelles qui régulent sa stabilité et par conséquent influence la durée du signal NOTCH1. L’activité transcriptionnelle de NIC1 est également régulée via le recrutement coordonné de cofacteurs transcriptionnels. Malgré tout, très peu de choses sont connues quant aux modifications post-traductionnelles pouvant moduler spécifiquement l’activité du complexe transcriptionnel formé par NIC1. De plus, les études jusqu’à présent n’ont pas permis d’identifier tous les partenaires d’interaction se retrouvant dans le complexe transcriptionnel NIC1/CSL/MAML1 et pouvant moduler son activité. Ainsi, l’objectif de cette étude était d’établir un système permettant l’identification de nouveaux partenaires transcriptionnels de NIC1. Nous avons exprimé une forme tronquée et constitutivement clivée de Notch1 et, suivant des analyses par spectrométrie de masse, nos résultats suggèrent l’interaction possible de NIC1 avec des membres du complexe médiateur et d’autres protéines impliquées dans la régulation génique. Nous avons également exprimé un NIC1-GFP et nos travaux ont permis de montrer qu’il était principalement localisé au noyau, où il s’associe à l’ARN polymérase II, et qu’il est dégradé par le protéasome. Suivant des analyses par spectrométrie de masse, nos résultats suggèrent l’interaction possible de NIC1 avec plusieurs régulateurs transcriptionnels et des protéines impliqués dans l’ubiquitination/Sumoylation. Bref, les analyses protéomiques sont un bon système d’exploitation pour l’identification de nouveaux partenaires d’interaction de NIC1. Ainsi, notre étude permettra une meilleure compréhension de la signalisation Notch d’apparence simple, mais plutôt complexe.

published_or_final_version / abstract / Surgery / Master / Master of Philosophy

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Translation and mRNA degradation are tightly regulated upon stress where protein synthesis and mRNA decay are modulated to optimize the stress response. However, the mechanisms that regulate mRNA decay and translation during stress are not fully understood. In this thesis, I show that Dcp2, a major decapping enzyme, undergoes phosphorylation by Ste20 kinase during stress and promotes stabilization of ribosomal protein mRNAs as well as Dcp2 accumulation in Processing bodies (P-bodies) in Saccharomyces cerevisiae. In addition, I have analyzed the role of P-bodies by examining how alterations in P-body assembly factors affect the transcriptome. Interestingly, I observe that Edc3, a component of P-bodies that promotes their assembly, can either stabilize or destabilize specific subsets of yeast mRNAs. I also show that Lsm4, a P-body component that mediates the assembly of P-bodies along with Edc3, promotes mRNA decay via its aggregation domain. These results argue that P-bodies can function as sites of mRNA degradation and storage for a subset of mRNAs by the localized accumulation of specific factors.

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