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Amélioration rationalisée de l'enzyme hyperthermostable SsoPOX. : Perpespectives de développement d'un bio-décontaminant d'organophosphorés et d'un agent anti-virulence bactérienne.Hiblot, Julien 13 June 2013 (has links)
Issue de l'Archaea extrêmophile Sulfolobus solfataricus, SsoPox est une enzyme à fort potentiel biotechnologique du fait de son extrême stabilité. Nous avons caractérisé son activité lactonase naturelle ainsi que son activité de promiscuité phosphotriestérase. Elle est capable d'hydrolyser les organophosphorés (OPs), des agents neurotoxiques utilisés en tant qu'insecticide et arme chimique de guerre dont les méthodes actuelles de décontamination restent insatisfaisantes. Non optimale, l'activité phosphotriestérase de SsoPox a été améliorée en redessiné in silico son site actif de afin qu'il ressemble à celui des PTEs, hydrolysant très efficacement les OPs. L'enzyme ainsi développée offre des perspectives d'utilisation pour la décontamination des pollutions aux OPs. L'activité lactonase de l'enzyme a également été améliorée envers certaines N-Acyl Homosérine Lactones (AHLs), des molécules impliquées dans la communication inter-bactérienne (quorum sensing). Or, le quorum sensing régule notamment la virulence bactérienne (e.g. Pseudomonas aeruginosa). Ainsi, l'utilisation de lactonases telles que SsoPox constituerait une alternative aux antibiotiques par interférence au quorum sensing (i.e. quorum quenching). L'ensemble de ces travaux a conduit au dépôt d'un brevet protégeant les séquences des variants améliorés ainsi que leurs domaines d'applications. Ils permirent également d'étudier des phénomènes clés dans l'évolution des enzymes tels que l'épistasie, la promiscuité et la flexibilisation. Ce projet, mêlant Sciences fondamentales et appliquées, pourrait, in fine, mener à la valorisation d'un projet de recherche académique. / Issued from the extremophilic Archaea Sulfolobus solfataricus, SsoPox exhibits an important biotechnological potential because of its extreme stability. Belonging to the phosphotriesterase-like lactonase family, its natural lactonase and promiscuous phosphotriesterase activities were characterized. The enzyme is able to hydrolyze organophosphates (OPs), i.e. nerve agents used as insecticides and chemical warfare agents for which current methods of decontamination are unsatisfactory. The phosphotriesterase activity of SsoPox is suboptimal unlike some mesophilic enzymes (PTEs). To develop a robust bio-decontaminant of OPs, we redesigned, in silico, SsoPox active site in the aim to mimic that of PTEs. Using a mutation database in an in vitro evolution protocol, we screened, selected and characterized efficient enzymes for OPs insecticides hydrolysis, offering prospects in OPs decontamination. SsoPox lactonase activity was also improved for some N-Acyl Homoserine Lactones (AHLs), molecules involved in the inter-bacterial communication (quorum sensing). Quorum sensing regulates several functions such as virulence of some pathogens (e.g. Pseudomonas aeruginosa). The use of lactonases such as SsoPox could constitute an alternative to antibiotics by quorum sensing (and thus virulence) inhibition (i.e. quorum quenching). These works were patented, protecting the sequences of improved variants and their fields of application. They also allowed to study key phenomena in enzyme evolution such as epistasis, promiscuity and flexibility. This project, combining basic and applied Sciences, could lead, in fine, to the promotion of an academic research project.
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Amélioration d'une enzyme hyperthermostable pour la dégradation des organophosphorés / Improvement of hyperthermostable enzyme for organophosphorus degradationJacquet, Pauline 19 December 2017 (has links)
Les organophosphorés (OPs) sont des composés neurotoxiques qui sont largement utilisés comme pesticides. Cette utilisation intensive a conduit à une importante pollution des sols et des effluents agricoles et sont retrouvés jusque dans les aliments. Ces pesticides sont responsables de 300 000 morts à travers le monde. Les OPs ont également été développés comme agents neurotoxiques de guerre tel que le sarin. Actuellement, il n’existe pas de méthode de décontamination externe satisfaisante pour dégrader les OPs, c’est pourquoi l’utilisation d’enzymes est une stratégie attractive. Parmi les enzymes capables de dégrader les OPs, les phosphotriestérases (PTEs) sont les plus actives mais sont peu stables ce qui limite leurs applications. Les enzymes hyperthermostables ont donc été considérées. Ainsi l’enzyme SsoPox, isolée de l’archée Sulfolobus solfataricus ayant une activité lactonase et une activité de promiscuité phosphotriestérase, a été plus particulièrement étudiée. SsoPox est extrêmement robuste mais son activité phosphotriestérase est en revanche plus faible. Une stratégie d’ingénierie protéique a été réalisée afin d’obtenir un compromis entre l’activité d'une PTE et la stabilité de SsoPox. En utilisant les similarités structurales entre ces deux enzymes, une base de données mutationnelle a été réalisée pour transférer le site actif hautement performant d’une PTE dans la structure hyperstable de SsoPox. Cette stratégie a permis d’obtenir des variants de SsoPox améliorés jusqu’à 2000 fois. L'efficacité de ces variants a été démontrée in vivo chez un modèle animal, la planaire, permettant d'améliorer la survie ainsi que la mobilité et la capacité de régénération. / Organophosphates (OPs) are neurotoxic compounds widely used as pesticides. Over the years, utilization of OP led to a considerable environmental contamination of soils and agricultural wastewaters, this pollution is furthermore a major health issue as these insecticides can be found in food. OP are highly toxic and are responsible for 300,000 deaths in the world every year. OPs were also developed as chemical warfare nerve agents such as sarin. Currently, no satisfying method for external decontamination is available, therefore bioremediation with enzymes is highly appealing. Among OP degrading enzymes, phosphotriesterases (PTEs) are the most active biocatalysts but are poorly stable what hinders their potential for bioremediation. Hyperthermostable enzymes from extreme environments were thus considered to circumvent this limitation. In particular, SsoPox isolated from the archaeon Sulfolobus solfataricus, displaying a lactonase activity and a promiscuous phosphotriesterase activity was deeply investigated. SsoPox is extremely robust but its activity for OP degradation is from far lower. A protein engineering strategy was started in order to reach a compromise between PTE activity and SsoPox robustness. Using structural similarities between PTEs and SsoPox, a mutational database was designed in order to transfer the highly performant active site of PTE into the hyperstable scaffold of SsoPox. This strategy led to variants displaying up to 2,000-fold increase against OPs as compared to wild-type enzyme. The variants efficiency was demonstrated in vivo using an original animal model planarian, allowed to enhance survival rate as well as mobility and regeneration capacity.
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