O melanoma maligno é o tipo de câncer de pele com pior prognóstico, devido à sua elevada probabilidade de causar metástases. Atualmente existem poucos tratamentos efetivos para o tratamento do melanoma, sendo que a sobrevida de pacientes que apresentam metástases é muito baixa, em torno de 8 meses, sendo que as taxas de cura nestas condições não ultrapassam 1%. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica seletiva e não invasiva, que vem demonstrando excelentes resultados clínicos no tratamento de tumores de pele do tipo não melanoma, como carcinoma espino e basocelular. O trabalho em questão aborda a efetividade da TFD, em linhagens humana de melanoma em diferentes fases de progressão da neoplasia, desde os estágios iniciais da doença (células de crescimento radial - RGP), até a fase metastática, não só em cultura de células em monocamada (2D), como também através do desenvolvimento de modelos celulares tridimensionais (3D), mistos ou não com fibroblastos humano, cuja proposta é mimetizar in vitro as reais condições de tumorigênese existentes in vivo, tais como o contato célula-célula entre as linhagens neoplásicas e os fibroblastos da derme, o contato célula-matriz extracelular (matriz de colágeno), além de propiciar o crescimento tumoral de forma livre de adesão ao substrato, o que é característico dos processos malignos. Em uma primeira etapa, o fármaco fotossensível Ftalocianina de Cloroalumínio (AlClPc) foi escolhido como agente fotossensibilizante utilizado nos estudos, sendo este encapsulado em vesículas lipossomais, propiciando a solubilidade do composto em meio aquoso, otimizando sua entrada nas células. As propriedades fotoquímicas e fotofísicas da formulação lipossomal foram avaliadas, garantindo que a encapsulação não interfere na capacidade fotodinâmica do agente. Como segunda etapa, a formulação foi testada nos modelos celulares 2D e 3D acima descritos, realizando-se não só estudos de toxicidade, mas também ensaios de morte celular (apoptose versus necrose), incorporação intracelular do fármaco (uptake), de forma quantitativa e também qualitativa, demonstrando a localização intracelular preferencial do fármaco. Tanto em culturas 2D como em culturas 3D, a formulação AlClPc lipossomal apresentou atividade farmacológica superior aos sistemas aplicáveis em TFD, já descritos na literatura, o que abre caminhos para a realização de estudos in vivo em animais com boas perspectivas de resposta ao tratamento do melanoma humano, com possibilidades de futuras aplicações clínicas. / Melanoma is the type of skin cancer with poor prognosis due to its high probability of suffering metastases. Currently there are few effective treatments for the this, and the survival of patients with metastases is very low, around 8 months, with cure rates of these conditions do not exceed 1%. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality selective and non-invasive, it has shown excellent clinical results in the treatment of non-melanoma skin cancers such as squamous and basal cell carcinoma. This work discusses the effectiveness of PDT in human melanoma cell lines in different stages of tumor progression, from the early stages of the disease (radial growth phase cells - RGP), to the metastatic stage, not only in cell culture in monolayer (2D), but also through the development of three-dimensional cellular models (3D), mixed or not with human fibroblasts, which aims to mimic in vitro, the real conditions existing in in vivo tumorigenesis, such as cell-cell contact between cancer cell lines and fibroblasts of the dermis, the contact cell-extracellular matrix (collagen matrix), as well as futher the growth of the tumor cells free from the substrate adhesion, which is characteristic of malignant processes. In a first step, the photosensitizer Cloroaluminum Phthalocyanine (AlClPc) was chosen to be used in the studies, which is encapsulated in liposomal vesicles, allowing the solubility of the drug in water, optimizing its intracellular incorporation. Furthermore, the photochemical and photophysical properties of the liposomal formulation were evaluated, ensuring that the encapsulation does not interfere with its photodynamic activity. As a second step, the formulation was tested in cellular models 2D and 3D above described, performing not only toxicity, but assays of cell death (apoptosis versus necrosis), intracellular drug incorporation (uptake), both quantitative and also qualitative, showing the main intracellular localization of the photosensitizer. Both in 2D cultures and 3D cultures, the liposomal AlClPc showed better pharmacological activity than the current applied PDT protocols, already described in the literature, and this is an open field for in vivo studies with animals with good prospects for responses to the treatment of human melanoma with possibilities for future clinical applications.

A Terapia fotodinâmica (TFD) é uma conhecida opção terapêutica para diversos tipos de lesões malignas e não-malignas. A TFD age por meio de uma reação fotoquímica, formando agentes oxidativos que causam inúmeros danos às estruturas subcelulares e posterior morte da célula. Em grande parte dos casos são necessárias várias sessões da TFD para erradicação completa da lesão neoplásica. No entanto, vários estudos clínicos têm sido publicados mostrando recrescimento tumoral e um aumento na resistência do tumor às sessões posteriores da TFD. Neste estudo apresentamos um modelo teórico para descrever os efeitos causados por sucessivas sessões da TFD quando ocorre recrescimento tumoral. Para isso, considera-se uma distribuição de dose limiar que representa a variedade celular de um modelo teórico de tumor. A existência de uma variedade de células com diferentes doses limiares pode ser a causa de uma resposta parcial do tecido à terapia, implicando em recrescimento do tecido tumoral. Neste modelo, assume-se que esta distribuição de dose limiar é representada por uma distribuição Gaussiana modificada. Em termos de dose limiar, valores mais altos implicam em maior resistência à TFD. Se a distribuição é larga, o tratamento não é capaz de eliminar todas as células. A fração de células que sobrevivem promovem o recrescimento tumoral; no entanto, a população de células no tumor recrescido apresenta diferentes características quando comparada com a população de células do tumor original. Para avaliar a ocorrência da seleção das células mais resistentes foi realizada uma investigação sobre as alterações da resposta das células tumorais, após múltiplas sessões da terapia fotodinâmica. Para simular este tipo de procedimento foram realizadas sucessivas sessões da TFD em culturas de células de hepatocarcinoma (HepG2). Entre as sessões de TFD foi aguardado um intervalo de tempo suficiente para que as células sobreviventes se reproduzissem e formassem uma nova cultura celular. O fotossensibilizador utilizado nos experimentos foi o Photogem® e a iluminação realizada em 630 ± 10nm. Os resultados dos experimentos in vitro forneceram evidências do aumento da resistência das células neoplásicas da linhagem HepG2 após sucessivas aplicações da TFD. Este aumento é previsto pelo modelo teórico e pode estar relacionado com a variação das características da população celular, que é expressa neste modelo pela distribuição de dose limiar. No entanto, o aumento da resistência da população celular à TFD previsto pelo modelo teórico é mais acentuado do que o aumento observado no experimento com culturas celulares, portanto, mais estudos serão necessários para adequar o modelo à condição real. Com base na variabilidade das células tumorais, as simulações demonstraram que a dose de luz insuficiente pode induzir um aumento da resistência do tumor às posteriores sessões da TFD. Este modelo poderá ser utilizado para avaliar qual o tipo de distribuição de dose limiar pode-se encontrar em tumores reais e quais as conseqüências causadas pela atenuação da luz em função da profundidade do tumor. A idéia apresentada neste estudo motivará novos estudos para identificar a importância da distribuição de dose limiar em tumores submetidos à TFD. / Photodynamic therapy is a well known treatment option for many types of malignant and nonmalignant lesions. This technique causes cell damage through a photochemical reaction, generating oxidative agents responsible for tumor cell killing. In several cases, multiple PDT-sessions are needed to promote cancer eradication. However, several clinical studies have been reported an increase of tumor resistance after a PDT-session. We present a theoretical model to describe the effects caused by successive PDT sessions based on the consequences of a partial response caused by the threshold dose distribution within the hypothetical tumor. In this model, we assume that this threshold dose distribution is represented by a Modified Gaussian Distribution. In terms of threshold dose, higher values imply higher resistance to PDT. If the distribution is broad, the treatment cannot result in the killing of all tumor cells. The survival cell fraction promotes a tumor regrowth with different characteristics compared to the original cell population. We applied the model in a hypothetical tumor to exemplify the idea here presented. The qualitative analysis extracted from our theoretical model shows a behavior that is in agreement with results obtained in our results from in vitro experiments and several clinical observations. To investigate the occurrence of a selection of higher threshold dose cells, an experiment that evaluated the response of tumor cells after multiple sessions of photodynamic therapy was carried out. To simulate this procedure, successive sessions of PDT in hepatocellular carcinoma cells (HepG2) were performed. A time interval between PDT-sessions was respected to allow surviving cells division, resulting in a new cell culture. The photosensitizer used in the experiments was Photogem® and a 630 ± 10nm irradiation was performed. The result of in vitro experiments provided evidence of increasing resistance of HepG2 cells after successive PDT-sessions. This increase is predicted by the theoretical model and may be related to variations in the tumor cell population, which is expressed by the variation of the distribution of threshold dose, according to the model. However, the increased PDT resistance of the cell population provided by the theoretical model is more pronounced than the one experimentally observed. Based on tumor cell variability, the simulations demonstrated that insufficient light dose can induce an increase in tumor resistance to further PDT sessions. This model maybe used to evaluate which type of threshold dose distribution we can find in real tumors, and the consequences caused by light attenuation observed from the illuminated surface and deeper tumor regions. This proposed model shows relative agreement to clinical literature. However, further experimental observations shall improve the model here presented. The idea presented in this study shall motivate further studies to identify the importance of cell threshold distribution in tumors submitted to PDT techniques.

A exposição crônica à radiação ultravioleta (UV) resulta no fotoenvelhecimento da pele humana. A fim de tratá-lo, a terapia fotodinâmica (TFD) - técnica que utiliza luz, um fotossensibilizador (FS) e oxigênio molecular - tem sido utilizada em ambientes clínicos, no entanto são escassas as investigações que revelam os achados histopatológicos desse tratamento na pele fotoenvelhecida. Com isso, o objetivo deste trabalho foi analisar experimentalmente os efeitos da TFD na pele fotoenvelhecida de camundongos por meio de técnicas ópticas e histológicas. Portanto, foram utilizados camundongos hairless (sem pelo) distribuídos aleatoriamente em diferentes grupos, tais como: Controle, animais de pele sadia envelhecida intrinsecamente, não irradiados com luz UV e não tratados; UV, animais irradiados com luz UV e não tratados; UV/Luz, animais irradiados com luz UV e tratados com fototerapia; UV/TFD, animais fotoenvelhecidos (irradiados com luz UV) e tratados com a TFD; e Controle/TFD, animais de pele sadia envelhecida intrinsecamente e tratados com TFD. A indução do fotoenvelhecimento foi realizada por diferentes fontes de luz contendo, principalmente, a banda espectral UV; para a TFD, foram utilizadas fontes de luz com comprimento de onda de 415, 630 e 635 nm (azul e vermelho) juntamente com o ácido 5-aminolevulínico (ALA), precursor do FS endógeno protoporfirina IX (PpIX). Para fazer o seguimento da TFD por técnicas ópticas, foram realizadas espectroscopia de fluorescência, imagem de fluorescência de campo amplo e tomografia por coerência óptica (OCT, do inglês optical coherence tomography). A avaliação histopatológica pós-TFD foi realizada com os corantes HE, Tricrômio de Masson (TM) e Verhoeff a fim de analisar a espessura da epiderme, o infiltrado inflamatório, o conteúdo de colágeno na derme e sua espessura e a qualidade das fibras elásticas. Como resultado, observouse aumento significativo da espessura da epiderme pela regeneração dos queratinócitos e deposição de novas fibras colágenas dérmicas apenas nos animais tratados com ALA-TFD, tanto irradiados quanto não-irradiados com luz UV (grupos UV/TFD e Controle/TFD, respectivamente). Assim, torna-se evidente que a TFD trata a pele fotoenvelhecida do camundongo hairless pelos achados histopatológicos e através das imagens de OCT. Com isso, este trabalho agrega informação às investigações clínicas a respeito da TFD no tratamento da pele fotoenvelhecida, atestando seu uso para o fotorrejuvenescimento cutâneo. / The chronic exposure to ultraviolet radiation (UVR) leads to photoaging of the human skin. As a treatment, the photodynamic therapy (PDT) which brings together light, a photosensitizer, and molecular oxygen has been extensively used on clinical trials; however, there are few studies that highlight the histopathologic findings regarding this technique on photoaged skin. Thus, the aim of this study was to analyze experimentally the effects of PDT on photoaged skin of hairless mice by means of optical and histopathologic assessments. For this, hairless mice were randomly allocated in different groups, such as: Control, animals with healthy aged skin, neither exposed to an UV lamp nor treated; UV, animals exposed to an UV lamp with no treatment; UV/Light, animals exposed to an UV lamp and treated just with light; UV/PDT, animals exposed to an UV lamp and treated with PDT; and Control/PDT, animals with healthy aged skin treated with PDT. The photoaging process was induced by different light sources, which had mainly the UV spectrum; for the PDT, light sources of different wavelengths (415, 630, 635 nm) were used (blue and red light sources) and the 5-aminolevulinic acid (ALA), PS precursor of the endogenous protoporphyrin IX (PpIX). In order to follow the PDT protocol up by means of optical techniques, we used fluorescence spectroscopy, fluorescence images and optical coherence tomography. The histopathologic assessment after the PDT procedure was performed with H&E, Massons Trichrome and Verhoeff stains for epidermal thickness, inflammatory infiltrate, dermal collagen content, dermal thickness, and quality of elastic fibers. As a result, it has been observed a significant epidermal thickening due to keratinocytes regeneration and newly formed dermal collagen fibers only on the groups treated with PDT-ALA (UV/PDT and Control/PDT groups). Therefore, it is evident that PDT treats the photoaged skin of hairless mice since histopatologic findings and OCT images have shown those morphology changes. In conclusion, this work add information to the clinical trials regarding the PDT as a reliable technique to treat photoaged skin, proving its use for the skin photorejuvenation.

O desenvolvimento de nanocarreadores a base de albumina são considerados biocompatíveis e biodegradáveis, e tem sido extensivamente estudada com objetivo de novas alternativas de tratamento para inúmeras doenças. A característica mais relevante reside no fato de que estes sistemas proteicos serem capazes de atravessar a barreira Hematoencefálica (BHE) e atingir as células-alvo, a partir de sinalizações por canais específicos na barreira cerebral. Por serem proteínas com ligações covalentes, pode-se afirmar que o processo de clivagem proteolítica tende a ser realizado pelas enzimas pertencente à família das proteases. Dada à importância desses sistemas de entrega de fármacos (DDS) e sua eficaz permeação através da BHE, propôs-se um desenvolvimento científico multidisciplinar combinando-se protocolos, técnicas e ensaios experimentais das áreas de tecnologia farmacêutica, nanotecnologia e química para realização da incorporação do fotoativo ou outros compostos, como a ftalocianina de cloro alumínio (AlClPc ou Pc) livre e/ou pré encapsuladas e as nanopartículas magnéticas, nestes sistemas de DDS conhecidos como nanopartícula de albumina (NpA). Dentre as técnicas usadas nestes estudos destaca-se tanto o método de cross-linking térmico (via Térmica) quanto o químico (via Química), sendo que no segundo, foram utilizados 2 reagentes distintos, o glutaraldeído e o gliceraldeído, os quais foram analisados e comparados neste projeto de pesquisa. Análises de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Microscopia de Força Atômica (MFA), medidas de estabilidade por ZetaSizer demonstraram claramente que as nanopartículas preparadas pelos diferentes reagentes possuíam formato esféricos, diâmetro médio em torno de 200 nm e eram homogêneas, entretanto, apenas os nanocarreadores preparados com GU apresentaram elevada repulsão eletrostática (prevenindo a agregação das mesmas). Após caracterização, os estudos foram baseados na utilização da AlClPc como fotoativo aplicado a terapia fotodinâmica (TFD) para o tratamento in vitro das doenças que acometem o sistema nervoso central (SNC). / The development of albumin-based nanocarriers, which are nontoxic and biocompatible and biodegradable, have been extensively studied for seeking new alternatives of the treatment for numerous diseases. The most relevant characteristic is that these protein-based systems could across the blood-brain barrier (BBB) and selectively achieve the target cells within of the brain. These nanocarriers are proteins-based and have covalent bonds, and consequently it can be digested by a class of enzymes belonging to the protease family, which rapidly degrade the protein-based nanoparticles through of the proteolytic cleavage process. Given the importance of these drug delivery systems (DDS) and their effective permeation through BBB, it was proposed a multidisciplinary scientific development combining protocols, techniques and experimental tests of the areas of pharmaceutical technology, nanotechnology and chemistry to carry out the incorporation of the photoactive or another compound, as aluminum chlorine phthalocyanine (AlClPc or Pc), free and/or pre-encapsulated or magnetic nanoparticles in these albumin-based DDS systems known as albumin nanoparticles (NpA). Among the techniques used in these studies we highlight by thermal cross-linking method (via Thermal) and chemistry (via Chemistry), in this second, it was used 2 reagents, glutaraldehyde and glyceraldehyde, that were analyzed and compared in this research project. From Scanning Electron Microscopy, Atomic Force Microcopy, Zeta potential measurements, we have clearly shown that the elaborated nanoparticles (NPs) have a smaller size with a spherical shape and are more homogeneous, however only the nanoparticles prepared with glutaraldehyde showed greater electronic repulsion (preventing their aggregation). After the characterization, the studies were based on the use of AlClPc as a photoactive applied in the photodynamic therapy (PDT) for the treatment of central nervous system (CNS) diseases.

A estomatite protética (EP), também designada de candidíase atrófica crônica, é a infecção fúngica bucal mais comum em indivíduos portadores de prótese total. Possui etiologia multifatorial, no entanto a presença de Candida spp. no biofilme da prótese é tida como o fator mais importante para o estabelecimento da EP. Este trabalho teve como objetivo avaliar o tratamento da EP por meio do uso da terapia fotodinâmica antimicrobiana (PDT), mediada pelo azul de metileno. Foram realizados estudos pré-clínicos e clínicos. Protótipos simuladores de prótese total foram confeccionados com polímero de metilmetacrilato, para servir de base para o crescimento do biofilme das seguintes espécies do gênero Candida: C. albicans, C. glabrata, C. dubliniensis, C. krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. guilliermondii. Como fotossensibilizador foi utilizada a solução de azul de metileno em uma concentração de 450μg/mL. Os protótipos com os biofilmes foram irradiados com um laser de comprimento de onda de 660 nm, potência de 100 mW, por um tempo de 80 segundos. Para o estudo clínico, os indivíduos foram divididos em dois grupos. O primeiro grupo recebeu tratamento convencional, à base do antifúngico Miconazol. O segundo grupo recebeu como tratamento a PDT. Os resultados pré-clínicos mostraram que todas as espécies do gênero Candida foram susceptíveis à PDT, ocorrendo uma redução de colônias que variou de 2,48 a 3,93 log10. Os resultados clínicos foram avaliados tanto quanto à redução de colônias de Candida spp. na mucosa e na prótese, como quanto à melhora do aspecto clínico da mucosa afetada. Tanto a terapia convencional quanto a PDT foram eficientes em tratar a EP. Não houve diferença estatística significante entre os tratamentos instituídos para nenhum dos fatores avaliados. Assim, concluiu-se que a PDT é efetiva no tratamento da estomatite protética. / Denture stomatitis (DS), also called chronic atrophic candidiasis, is the most common oral fungal infection in denture wearers. It has a multifactorial etiology, but the presence of Candida spp. biofilm on the denture is considered the most important factor for the establishment of the DS. This study aimed to evaluate the treatment of DS through the use of photodynamic antimicrobial therapy (PAT), mediated by methylene blue. For this purpose, preclinical studies and clinical trials were performed. Simulators prototypes dentures were made of methyl methacrylate polymer to serve as a basis for biofilm growth of the following species of Candida: C. albicans, C. glabrata, C. dubliniensis, C. krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis and C. guilliermondii. Methylene blue solution at a concentration of 450μg/mL was used as a photosensitizer. The prototypes and biofilms were irradiated with a laser of wavelength of 660 nm, potency of 100 mW, for 80 seconds. For the clinical study, subjects were divided into two groups. The first group received conventional treatment based on the use of antifungal Miconazole. The second group received the treatment by PAT. The preclinical results showed that all species of the genus Candida were susceptible to PAT, with a reduction in colonies that ranged from 2.48 to 3.93 log10. Clinical outcomes were evaluated for the reduction of colonies of Candida spp. located in the mucosa and in the prosthesis and relative to the improvement of the clinical aspect of the affected mucosa. Both the conventional therapy and PAT were effective in treating DS. There was no significant statistical difference between PAT and conventional treatment for any of the factors evaluated. Thus, it was concluded that PAT is effective in the treatment of denture stomatitis.

BERTOLINI, WAGNER L. H. M. A influência do D-limoneno como promotor de absorção do ácido 5-aminolevulínico para Terapia Fotodinâmica do câncer de pele: avaliação in vitro e in vivo da permeação e retenção cutâneas. 2009 118f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. O câncer é a segunda doença principal do planeta, muito próximo de se tornar a mais incidente. Os tratamentos tradicionais do câncer, tais como cirurgia, radioterapia e quimioterapia apresentam severos efeitos colaterais ao paciente devido à citotoxicidade que podem causar às células normais, além das cancerosas. Objetivando minimizar estes efeitos indesejáveis pesquisadores de diversas áreas afins vislumbram novas técnicas, novos tipos e formas de tratamentos que apresentem um melhor perfil terapêutico; que possam agir de forma mais seletiva contra as células cancerosas, minorando os efeitos indesejáveis em relação às células saudáveis. Dentre as técnicas pesquisadas destaca-se a Terapia Fotodinâmica (TFD). Esta é uma técnica de tratamento nova e promissora. A técnica do tratamento consiste em aplicar, no tecido alvo, substâncias fotossensibilizantes, posteriormente ativadas com luz de comprimentos de onda específicos, com a finalidade de produzir destruição celular, por meio da ação de produtos citotóxicos fotoativados. Destaca-se a seletividade apresentada pela técnica, que deve ser reconhecida como uma das vantagens entre as técnicas empregadas no tratamento do câncer. O presente trabalho objetiva verificar a influência do D-limoneno como promotor de permeação do ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) em aplicação tópica. Isto visa aumentar a permeação do 5-ALA quando aplicado topicamente. O 5-ALA é convertido a protoporfirina-IX (PpIX) pela via do ciclo Heme. Esta é um potente agente fotossensibilizador endógeno. O interesse no uso deste promotor foi aumentar a taxa de penetração do 5-ALA, possibilitando a permeação de maiores quantidades do fármaco em questão. Para isto foram realizados estudos de permeação in vitro do 5-ALA, em concentração de 1% (p/p) utilizando-se formulações (emulsões O/A) com diferentes concentrações do promotor D-limoneno (0, 5, 10, 20 e 30%), (p/p). Observou-se que o fluxo in vitro do 5-ALA através da pele de orelha de porco aumentou para todas as formulações empregadas quando comparado ao controle, sem D-limoneno, para um período de estudo de 12h. A retenção no estrato córneo e na [epiderme + derme] apresentou aumento significativo, evidenciando, assim, um efeito eficiente do D-limoneno como promotor. Experimentos in vivo foram conduzidos em camundongos objetivando a análise do efeito da formulação na produção e acúmulo de PpIX na pele. Observou-se que o D-limoneno aumentou significantemente a quantidade de PpIX extraída da pele. Os resultados in vitro e in vivo mostraram o potencial do D-limoneno como promotor de absorção cutânea para o 5-ALA para a TFD tópica do cancer de pele. / BERTOLINI, WAGNER L. H. M. D-limonene influence in the cutaneous penetration enhancer for 5-aminolevulinic acid in photodynamic therapy of skin cancer: in vitro and in vivo skin permeation and retention studies. 2009 118f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. The topical administration of 5-ALA has been distinguished on skin cancer photodynamic therapy (PDT) because of its efficiency in the treatment of tumors and the reduced phototoxic collateral effects. However, this effectiveness is limited by its low penetration in the skin. A proposal to optimize the 5-ALA penetration in the skin is the use of cutaneous penetration enhancers, which seek to alter the cutaneous barrier for many bioactive molecules. The aim of this work was the pharmaceutical development of formulations containing D-limonene as a cutaneous penetration enhancer, seeking the increase of the cutaneous penetration of 5-ALA for skin cancer PDT. The in vitro flux of 5-ALA present in 1% (w/w) from different formulations containing D-limonene (20 e 30% w/w) was significantly increased after 12 hours of experiment, in comparison with formulations without D-limonene, mainly for the formulations containing 20% and 30% of D-limonene with 1% of 5-ALA (1,45 and 2,01 times, respectively). The stratum corneum (SC) and [epidermis + dermis] without SC retention were also significantly increased, showing an enhancer effect of the promoter. In addition, in vivo experiments were accomplished in mice, with the purpose of analyzing the formulation effect on the PpIX production and accumulation in the skin. It was observed that the penetration enhancer\'s presence significantly increased the amount of PpIX extracted from the skin. Both in vitro and in vivo results showed the potentiality of the formulations containing D-limonene as a cutaneous penetration enhancer for 5-ALA delivery on the skin cancer PDT.

As propriedades fotofísicas e fotoquímicas de cristal violeta (CV) foram investigadas em soluções isotrópicas e verificou-se que solventes com constante dielétrica pequena favorecem a formação do par iônico, já o aumento na viscosidade do meio restringe a movimentação rotacional dos anéis aromáticos, resultando em um aumento no tempo de vida de fluorescência e, portanto no rendimento quântico de fluorescência (Φf) (Oliveira 2002). Os experimentos com CV foram conduzidos em micelas reversas do tensoativo aniônico bis-2-etilhexil sulfoccinato de sódio (AOT) em isooctano. A localização interfacial do CV nas micelas reversas de AOT em valores da razão molar entre água e surfactante (W0)pequenos e grandes foram encontrados através da técnica de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de próton e de carbono 13. Utilizando-se espectroscopia UV-Vis identificou-se que pares iônicos de contato estão presentes a valores pequenos de W0 e com o aumento do W0 pares iônicos separados por solventes são as espécies que predominam em solução. A comparação da eficiência de fotodegradação de CV em micelas reversas de AOT em função do W0 indicou que a fotoreatividade é maior em baixos valores de W0 . Este efeito deve estar relacionado à restrição da movimentação dos anéis aromáticos de CV devido ao ambiente restrito no qual este se localiza na micela reversa de OAT a W0 pequenos. A formação de intermediários reativos foi verificada através de Fotólise de Relâmpago a Laser e Emissão no infra-vermelho próximo, indicando a presença de espécies triplete, radical e oxigênio singlete com valor de rendimento quântico menor que 1%. Os produtos de fotólise foram identificados por técnicas cromatográficas e espectroscópicas. Na presença de oxigênio, houve maior formação de cetona de Michler. Com baixa concentração de oxigênio, o produto observável foi leuco-CV. Destes estudos propomos o mecanismo de CV neste meio. Após os estudos com micelas reversas, células cancerosas HeLa foram empregadas para comparar fotoatividade do CV com o azul de metileno (MB). As proporções de CV e MB dentro das células são altas, incorporando 70% e 80% da concentração da solução de incubação, respectivamente. Com o aumento da concentração de MB, um favorecimento da formação de dímero foi identificada. Já CV não sofre agregação nas condições estudadas. Nenhum dos fotossensibilizadores estudados tem um efeito danoso sobre as células HeLa em concentrações abaixo de 10µM. Após irradiação, MB causou uma diminuição de cerca de duas vezes maior na taxa de sobrevivência celular comparado com CV. A formação de formação de oxigênio singlete após incorporação dos fotossensibilizadores foi investigada. Há formação de oxigênio singlete em células incubadas com MB, já com CV a geração de oxigênio singlete é pouco significativa sugerindo um mecanismo radicalar. O processo de morte celular foi estudado por citometria de fluxo e verificou-se que MB induz apoptose depois da irradiação em células HeLa. A absorção de luz por ambos fotossensibilizadores é similar, o que indica que a diminuição na sobrevivência não se deve à diferença de absorção luminosa. As diferenças de sobrevivência observadas com células incubadas com CV e MB e irradiadas foram relacionadas às diferenças das propriedades fotoquímicas destes fotossensibilizadores. A localização celular de CV e MB em células foram caracterizadas por microscopia de fluorescência. Verificou-se que ambos localizam-se em mitocôndrias. O aumento na concentração de CV não alterou o seu perfil de localização. Já para MB ao aumentar a concentração de MB, observa-se que o mesmo localiza-se além das mitocôndrias, em lisossomos. A comparação das propriedades fotoquímicas e de localização foram consideradas para explicar as diferenças de atividade fotodinâmica do CV e do MB em células HeLa / The photophysical and photochemical properties of crystal violet (CV) were investigated in isotropic solutions and it was found that solvents with small dielectric constants favor the formation of the ion pair and that the increase in viscosity of the medium restricts the rotational movement of the aromatic rings, resulting in an increase in fluorescent lifetime and therefore in the fluorescence quantum yield (Φf) (Oliveira 2002). CV experiments were conducted in reverse micelles of the anionic tensoactive sodium bis-2-ethylhexyl-sulfosuccinate (AOT) in isooctane. The interfacial localization of CV in the AOT reverse micelles at low and high values of molar ratio between water and surfactant (W0 was found through the proton and carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance techniques (NMR). Using UV-Vis spectroscopy, it was identified that contact ion pairs are present in low W0 values and with the increase in the W0 solvent separated ion pairs are the species that predominate in solution. The comparison of the photobleaching efficiency of CV in AOT reverse micelles as a function of W0indicated that the photoreactivity is high with low W0 values. This effect must be related to the restrict environment in which CV is located. The reactive intermediate formation was found through the Laser Flash Photolysis and Near Infra-Red Emission, indicating the presence of triplet, radical and singlet oxygen species with a yield quantum of less than 1%. The photolysis products were identified through the chromatographic and spectroscopic techniques. In the oxygen presence, there was high Michler ketone formation. With the low oxygen concentration, the observable product was leuco-CV. With these studies we hypothesized a mechanism of CV in these proposed media. After the reverse micelles studies, the HeLa cancerous cells were used, in order to compare the CV and methylene blue (MB) photoactivity. The CV and MB proportion inside the cell was high, reaching 70% and 80% of concentration of the incubation solution, respectively. With the increase of MB concentration, a favoring of dimmer formation was identified. CV does not suffer aggregation in the studied conditions. None of the studied photosensitizers has a damaging effect upon the HeLa cells in concentrations below 10µM. After irradiation, MB caused a decrease about twice higher in the cellular survival rate compared to CV. The singlet oxygen formation after the photosensitizer incorporation was investigated. There is a singlet oxygen formation in the cells incubated with MB, though with the CV the singlet oxygen generation is significantly low suggesting the radicalar mechanism. The cellular death process was studied by Fluorescence Activated Cell Sorting and MB-induced apoptosis was found after MB irradiation in HeLa cells. The light absorption by both photosensitizers is similar, which means that the survival decrease is not because of the light absorption difference. The survival differences observed with the cells incubated with CV and MB and irradiated were related to the differences in the photosensitizer photochemical properties. The cellular location of the CV and MB in cells were characterized by fluorescence microscopy. Both photosensitizers are located in mitochondrias. An increase in the CV concentration does not alter its local profile. However, with an increase in the MB concentration, MB was located not only in mitochondrias but also in lysosomes. The comparison of the photochemical and localization properties was considered in order to explain the differences in the photodynamic activity of CV and MB in HeLa cells

A reabsorção óssea alveolar associada as perdas dentais constitui uma condição inerente ao processo de cicatrização fisiológico natural. Técnicas como a instalação de implantes imediatos e técnicas de preservação alveolar têm sido sugeridas com o objetivo de limitar as alterações adversas sofridas pelo processo alveolar. Contudo, frequentemente as perdas dentárias estão associadas a infecções crônicas que tradicionalmente contraindicariam os procedimentos de enxerto ou implantes imediatos, a menos que meticulosos debridamento e irrigação alveolar associados a adequado protocolo antibiótico pré e pós-operatório sejam empregados. Alternativas precisam ser testadas para a substituição do uso indiscriminado de antibioticoterapia sistêmica. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da TFDa na descontaminação de alvéolos infectados previamente a instalação de implantes imediatos e na cicatrização de alvéolos pós-extração associados ou não ao uso de enxertos xenógeno através de análises microtomográficas e histomorfométricas. Para tanto, foram selecionados 8 cães, os quais foram submetidos a uma fase de indução de doença periodontal por ligadura, seguida por um período de estabelecimento da doença. Após a exodontia dos prémolares bilaterais, aleatoriamente os alvéolos de um lado da mandíbula foram descontaminados por debridamento mecânico associado a irrigação com solução salina (grupo controle) e do outro lado por debridamento mecânico e irrigação com solução salina associados a terapia fotodinâmica antimicrobiana (grupo teste), e subsequentemente submetidos a instalação de implantes imediatos, dando origem aos grupos GT-I (Grupo Teste - Implante) e GC-I (Grupo Controle - Implante). Os demais alvéolos, foram utilizados para o estudo da dinâmica de cicatrização alveolar. Os sítios foram aleatoriamente alocados em: GT-C (Grupo teste - Coágulo), GT-BO (Grupo Teste - Bio-Oss®), GT-BOC (Grupo Teste - Bio-Oss® Collagen), GC-C (Grupo Controle - Coágulo), GC-BO (Grupo Controle - Bio-Oss®) e GC-BOC (Grupo Controle - Bio-Oss® Collagen). Após 12 semanas, os cães foram sacrificados e as amostras processadas para as análises de microtomografia computadorizada, histologia e histomorfometria. Na avaliação da cicatrização dos alvéolos pós-extração, embora os alvéolos descontaminados com TFDa (GT-C, GT-BO, GT-BOC) tenham apresentado melhores resultados numéricos, em relação a altura da crista óssea vestibular (ACOV) e a dimensão buco-lingual (DBL), não foram evidenciadas diferenças relevantes na análise histomorfométrica. Apenas a ACOV, mensurada na avaliação microtomográfica bidimensional, demonstrou-se significativamente inferior nos alvéolos do grupo teste que não receberam material de enxerto (GT-C) quando comparados aos respectivos alvéolos do grupo controle (GC-C). Na avaliação dos implantes imediatos, a análise histomorfométrica dos parâmetros: reabsorção da crista óssea vestibular (RCOV) e contato osso implante (BIC) demonstrou resultados significantemente superiores no GT-I em relação ao GC-I, e do parâmetro densidade óssea (DO) demonstrou apenas resultado numericamente superior no GT-I em relação ao GC-I. Todas as análises microtomográficas bidimensionais (RCOV) e tridimensionais (volume ósseo BV, porcentagem óssea BV/TV, densidade de superfície óssea BS/TV, espessura trabecular Tb.TH, número de trabéculas Tb.N e separação trabecular Tb.SP) demonstraram resultados significantemente melhores nos implantes do grupo teste (GT-I) em relação aos implantes do grupo controle (GC-I). A TFDa demonstrou potencial como agente de descontaminação de alvéolos pósextração periodontalmente infectados, previamente a instalação de implantes imediatos e na cicatrização de alvéolos pós-extração associados ou não a materiais de enxerto xenógenos, sem o uso de antibioticoterapia sistêmica associada. / Alveolar bone resorption following tooth loss is an inherent condition of the natural healing process. Therefore, several techniques, such as immediate implants placement and post extraction socket preservation, have been suggested in order to limit the adverse changes suffered by the alveolar process. However, extraction sockets commonly results from the removal of teeth affected by chronic infection, which conventionally contraindicates immediate bone graft and implant placement unless meticulous wound debridement and alveolar irrigation associated to a suitable pre- and post-operatory antibiotic protocol are employed. Alternatives ought to be tested in order to substitute the indiscriminate use of systemic antibiotic therapy. The aim of the present study was to evaluate the effect of the antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) in the decontamination of infected post extraction sockets, previously to immediate implant placement and in the healing of post extraction sockets associated or not to xenografts. In the first phase, periodontitis was induced with ligatures in the mandibular premolars of eight beagle dogs. After 2 months, in the second phase of the study the dogs had their mandibular bicuspids bilaterally extracted, and randomly one hemi-mandible was decontaminated by mechanic debridement associated to saline solution irrigation (Control Group - CG), and the other hemi-mandible was decontaminated with mechanic debridement and saline solution irrigation associated to antimicrobial photodynamic therapy (Test Group - TG). Thereafter, 3 immediate implants in each side of the mandible were placed and the following groups were devised: TG-I (Test Group - Implant) and CG-I (Control Group - Implant). The remaining sockets were used for the study of the healing dynamic. The sockets were randomly assigned to the following groups: Test Group - Blood clot (TG-BC), Test Group Bio- Oss® (TG-BO), TG - BOC (Test Group Bio-Oss® Collagen), Control Group - Blood Clot (CG-BC), Control Group - Bio-Oss® (CG-BO) and Control Group - Bio-Oss® Collagen (CG-BOC). After 12 weeks, the dogs were sacrificed and the specimens were processed for microtomographic, histological and histomorphometric analysis. When the post extraction healing process was evaluated, the aPDT decontaminated sockets (TG-BC, TG-BO and TG-BOC) presented better numerical results in comparison to both buccal bone crest height (BCL) and in the bucco-lingual dimension (BLD). However, there were no statistically differences among the groups for these parameters in the histomorphometric analysis. Only the BCL measured in the two-dimensional microtomographic analysis showed statistic better results in the TG-BC when compared to the CG-BC. In the evaluation of the immediate implant placement the histomorphometric analysis presented statistically better results for the TG-I in the bone-implant contact (BIC), as well as in the vertical buccal bone loss (VBBL). The bone density (BD) was numerically better in the TG-I than in the CG-I. Both two-dimensional (VBBL) and three-dimensional (bone volume BV, percentage of the total bone volume - BV/TV, bone surface density - BS/TV, trabecular thickness Tb.Th, trabecular separation Tb.Sp and trabecular number TB.N) microtomographic analysis showed statistically better results in the TG-I. The aPDT showed potential in the decontamination of infected post extraction sockets previously to immediate implant placement and in the healing of post extraction sockets associated or not to xenogeneic grafts, without the use of systemic antibiotics.

A terapia fotodinâmica (TFD) utilizando ácido 5-aminolevulinico (ALA) e derivados em aplicação tópica e, como precursor da protoporfirina IX (PPIX) apresenta alguns limitantes relativos a baixa permeação das substâncias na pele. Comportamento este que afeta a produção e homogeneidade da distribuição da PPIX na superfície e camadas mais profundas da pele. Para resolver essa limitação muitos autores propõem alternativas modificando a molécula do ALA e derivados, bem como modificando as propriedades químicas da fase externa da emulsão (mais hidrofílica ou hidrofóbica) ou então o sistema de entrega para a emulsão. O objetivo desse estudo é avaliar qual a proporção de ALA e metil-5-aminolevulinato (MAL) que quando misturados levam ao aumento da quantidade e uniformidade da formação da PPIX na superfície e em profundidade na pele. Para esse estudo foi realizada análises de fluorescência e histologia. O estudo foi conduzido in vivo e ex vivo usando biópsias de pele de porco cultivadas in vitro. A produção de PPIX foi monitorada utilizando espectroscopia de fluorescência, imagem de fluorescência de campo amplo e microscopia confocal de fluorescência. E para a aplicação da TFD os parâmetros usados foram de 125 mW/cm2 de intensidade e 150 J/cm2 de dose. A análise do dano causado pela irradiação foi realizada por meio de histologia da pele após 24 e 48 horas da aplicação da TFD. O ALA e MAL na concentração de 20% foram misturados nas seguintes proporções: ALA ou M, M2 (80% ALA - 20% MAL), M3 (60% ALA 40% MAL), M4 (50% ALA MAL), M5 (40% ALA 60% MAL), M6 (20% ALA 80% MAL) e MAL como M7. As diferentes proporções foram incorporadas em emulsões óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O). De acordo com os resultados, as misturas M3, M4 e M5 mostraram maior produção de PPIX na superfície da pele segundo as medidas de fluorescência em 3h de incubação e, no estudo da cinética mostraram produzir PPIX em menor tempo. No estudo de permeação do creme in vitro em pele ex vivo, por microscopia confocal de fluorescência, observou-se que as misturas M3, M4 e M5 produziram mais PPIX nas camadas da pele do que ALA e MAL. As análises histológicas das misturas apresentaram maior dano fotodinâmico na superfície e profundidade das camadas da pele após a TFD, independente da emulsão. A análise em até 48h observou-se predominantemente a fase do processo de reparo referente à fase inflamatória, mas existem indícios ao longo das análises tanto macroscópicas e histológicas que o processo de reparo referente as fases subsequentes de proliferação e remodelamento estão iniciando-se em paralelo. A mistura M4 em ambas as emulsões apresentou elevada quantidade de formação de PPIX em menor tempo de incubação. M4 em emulsão O/A apresentou menor dano fotodinâmico já que a evolução do processo reparo foi mais rápida sugerindo-se potencial de aplicação em TFD voltado para área cosmética-estética. Já M4 em emulsão A/O levou a um maior dano fotodinâmico já que a evolução do processo de reparo foi mais lenta sugerindo-se potencial de aplicação em TFD voltado para área oncológica e de doenças de pele. De modo geral o estudo proposto apresentou impacto positivo para a otimização da terapia fotodinâmica em aplicação tópica. / Photodynamic therapy (PDT) using 5-aminolevulinic acid and derivatives on topical application and as a precursor of protoporphyrin (PPIX) has some limitations for low permeation of substances into the skin. This behavior affects PPIX production and homogeneous distribution on the surface and deeper layers of the skin. To resolve this limitation, many authors propose alternatives such as modifying the molecule of ALA and its derivatives, as well as changing the chemical properties of the external phase of the emulsion (more hydrophilic or hydrophobic) or the delivery system to the emulsion. The aim of this study is to assess the proportion of ALA and methyl-5-aminolevulinate (MAL) that when mixed leads to an increase in the amount and uniformity of the PPIX formation on surface and deep skin. For this study we performed fluorescence analysis and histology. The studies were conducted in vivo and also using pig skin biopsies (ex vivo) cultured in vitro. The PPIX production was monitored using fluorescence spectroscopy, widefield fluorescence imaging, and fluorescence confocal microscopy. For the application of PDT an intensity of 125 mW/cm2 and a dose 150 J/cm2 were used. Analysis of the damage caused by irradiation was performed through skin histology after 24 and 48 hours after PDT application. ALA and MAL in concentration of 20% were mixed in the following proportions: ALA or M, M2 (80% ALA - 20% MAL), M3 (60% ALA - 40% MAL), M4 (50% ALA - MAL) M5 (40% ALA - 60% MAL), M6 (20% ALA - 80% MAL) MAL and as M7. Different proportions were incorporated in oil-in-water emulsions (O/W) and water-in-oil (W/O). The fluorescence measurements for 3h of incubation showed better PPIX production in the skin surface for mixtures M3, M4 and M5. Moreover, the kinetics study showed PPIX production in less time for these mixtures. In the study of cream permeation of ex vivo skin in vitro by confocal fluorescence microscopy, we observed that the mixtures M3, M4 and M5 produced more PPIX in the skin layers than ALA and MAL. The histological analyses of the mixtures showed higher photodynamic damage on the surface and deeper layers of the skin after PDT, independent of the emulsion. The analysis in 48 hours predominantly observed the phase of the healing process regarding the inflammatory phase but there are signs along both macroscopic and histological analysis that the healing process concerning the subsequent stages of proliferation and remodeling are initiating in parallel. The mixture M4 in both emulsions had high amounts of PPIX formation in shorter incubation time. M4 emulsion O/A showed a lower photodynamic damage since the evolution of the healing process was faster suggesting to potential application in PDT facing cosmetic-aesthetic area. M4 already in W/O emulsion led to a greater photodynamic damage since the evolution of the healing process was slower suggesting to potential application in PDT facing oncology and skin diseases. Overall the proposed study had a positive impact on the optimization of photodynamic therapy for topical application.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica promissora que tem mostrado resultados clínicos efetivos, a lém de custo benefício favorável ao sistema de saúde. Embora a TFD esteja associada à indução de morte celular por necrose e, ou apoptose, pesquisas recentes comprovam a ativação da autofagia. Visando entender a relação entre a quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs), produzidas após fotoativação dos fotossensibilizadores (FSs), com a indução de morte autofágica, foram utilizados os FSs fenotiazínicos estruturalmente semelhantes, azul de metileno (MB) e 1,9-dimetil azul de metileno (DMMB); as linhagens celulares HeLa e HaCat, como modelos biológicos e LEDs emitindo em 633 nm, como fonte luminosa. Os ensaios de viabilidade em função da dose de luz e da concentração dos FSs verificaram que o aumento de morte celular está diretamente relacionado ao aumento da concentração e ao aumento da dose de luz, para ambos FSs. Verificou-se que nas condições de IC50 a concentração do DMMB (10 nmol/L) é menor que a do MB (2,0 µmol/L) em duas ordens de grandeza, e essa diferença também se reflete no grau de desbalanço oxidativo gerado após fotossensibilização. Foi verificado que para o MB, a elevada geração de EROs está fortemente correlacionada com a perda de viabilidade, enquanto que para o DMMB essa correlação é fraca, uma vez que há perda de sobrevida sem grandes gerações de EROs. No entanto, a diminuição de sobrevida causada pelo DMMB se correlaciona forte e significativamente ao aumento da autofagia, indicando ocorrência de morte celular autofágica tanto em células HaCaT quanto em células HeLa. As análises de dano em organelas indicaram que ambos FSs, após serem fotoativados, causam danos em lisossomas e em mitocôndrias de células HaCaT. E confirmou-se, por ensaio de localização subcelular, que ambos FSs estão nessas organelas. Uma vez que a localização subcelular do FS influencia no mecanismo de morte celular foto desenvolvido, verificou-se que o MB nas mesmas concentrações nanomolares do DMMB não induz autofagia, pois o mesmo encontra-se fotoquimicamente inativo nas mitocôndrias, devido à redução pelas coenzimas presentes nesta organela. O DMMB possui um potencial de redução menor que o MB, o que impede a redução deste FS nas mitocôndrias, e, mesmo em baixas concentrações, o DMMB é capaz de comprometer a integridade de mitocôndrias e lisossomas, e induz ir autofagia como um mecanismo de morte celular. As condições em que o MB não se encontra totalmente reduzido no ambiente celular são em concentrações mais elevadas, nas quais a geração do nível de estresse oxidativo é maior e não se observa resposta autofágica após fotossensibilização. Esses resultados mostram que a eficiência de morte celular causada por TFD não está necessariamente relacionada ao nível de estresse oxidativo gerado, uma vez que o DMMB induziu estresse oxidativo em menor extensão do que MB e, no entanto, induziu morte celular em maior extensão. Confirmou-se o conceito de que, fotossensibilizadores mais eficazes para a TFD devem resultar da melhoria na especificidade das reações de fotossensibilização nos alvos celulares e não apenas em melhoria na eficiência de geração de ERO. / Photodynamic Therapy (PDT) is a promising therapeutic modality that has shown effective clinical outcomes and benefits in terms of costs to the national health system. Although PDT is associated with induction of cell death by necrosis or apoptosis, recent data suggest the activation of autophagy. In order to understand the relationship between reactive oxygen species (ROS), generated after light activation of photosensitizers (PSs), and the autophagic cell death induction, we have used two phenothiazines with similar structure - methylene blue (MB) and 1,9-dimethyl methylene blue (DMMB); HaCaT and HeLa cells were used as biological models and LEDs emitting at 633 nm were used as light source. Cell viability assays as function of light dose and PS concentration showed that the increase in cell death was directly proportional to the PS concentration and light dose, to the both PSs. At IC50 was verified that DMMB concentration (10 nmol/L) is lower than MB concentration (2,0 µmol/L) in two order of magnitude, and this difference is reflected in degree of oxidative stress promoted by photosensitizers . Only for MB the amount of detected ROS is highly correlated with loss of cell viability, while for DMMB this correlation is weak, because there is loss of viability without large generation of ROS. Nevertheless, the viability decreased for DMMB is highly correlated with the increase of autophagy, indicating occurrence of autophagic cell death in both HaCaT cells and in HeLa cells. The analyses of damaged cell organelles indicated that both PSs, after be photoactivated, induce lysosomal and mithochondrial damage in HaCaT cells. And the subcellular localization assay confirmed that DMMB and MB are localized in these organelles. Because the subcellular localization of PSs influences cell death mechanisms, this research identified that MB, in the same nanomolar concentration of DMMB, does not induce autophagy, because it is photochemically inactive in mitochondria due the reducing coenzymes present in this organelle. DMMB has a lower reduction potential than MB, which hinders PS reduction in mitochondria, and possibly generate a mild oxidative stress that compromise the integrity of mitochondria and lysosomes, and justify autophagy induction as a cell death mechanism. The conditions that MB is not fully reduced in the cellular environment are at higher concentrations, in which was detected high level of oxidative stress and autophagic cell death was not observed after photosensitization. These results show that the efficiency of cell death induced by PDT is not necessarily related with oxidative stress level, since the oxidative stress induced by DMMB was lesser than by MB, however, the cell death was greater. This research confirms the concept that more effective photosensitizers for PDT means greater specificity of photosensitization reactions, and not only improvement of the efficiency of ROS generation.