Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-03-04T19:06:35Z No. of bitstreams: 1 2014_EderAlvesBarbosa.pdf: 4378638 bytes, checksum: 00877b1f9ca18fc438dfee9ec43f6fb0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-29T21:01:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_EderAlvesBarbosa.pdf: 4378638 bytes, checksum: 00877b1f9ca18fc438dfee9ec43f6fb0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_EderAlvesBarbosa.pdf: 4378638 bytes, checksum: 00877b1f9ca18fc438dfee9ec43f6fb0 (MD5) / Esse trabalho descreve um modelo experimental o qual emprega análises da expressão de peptídeos da secreção cutânea de anfíbios, com enfoque nas variações dos níveis de transcrição de genes de interesse e no mapeamento de peptídeos estocados nas glândulas granulares. A partir desse modelo, foram utilizadas ferramentas de biologia molecular e espectrometria de massa para investigar processos de maturação das glândulas granulares em Phyllomedusa azurea durante a metamorfose e para avaliar como esse anfíbio responde a diferentes estímulos. Os resultados evidenciam a presença dos peptídeos no tecido cutâneo, em pequenas concentrações, apenas a partir do estágio 41 de desenvolvimento. Um súbito aumento da concentração de peptídeos na pele de P. azurea é observado quando este migra para o hábitat terrestre. Contudo, mesmo logo após o término da metamorfose, as glândulas granulares não apresentaram o mesmo padrão de conteúdo peptídico do animal adulto. Os resultados indicam também que glândulas individuais armazenam um conteúdo próprio e que a presença de microrganismos modula tanto os processo de transcrição gênica, quanto os de tradução e estocagem de peptídeos. Ainda, fundamentado no modelo experimental proposto, a expressão diferencial de peptídeos nas glândulas granulares dorsais e inguinais foi investigada em anfíbios adultos da espécie Physalaemus nattereri. Observa-se, a partir dos resultados, que peptídeos antimicrobianos foram flagrados uniformemente distribuídos ao longo de todo o tecido cutâneo de P. nattereri, ao passo que os peptídeos relacionados a bradicininas são preferencialmente sintetizados nas glândulas inguinais. Isto sugere uma fina sintonia entre o sistema fisiológico e o comportamento deimático apresentado por esse anfíbio. O modelo experimental apresentado aqui pode ser estendido a outros grupos de animais, assim como, em experimentos que envolvam questionamentos relacionados a interações peptídeos/proteínas em tecidos das mais diversas origens. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work describes a strategy that involves peptide frog skin expressing analysis, based on RNA transcription level measurement and glandular peptide skin mapping, to respond biological relevant questions. The chosen experimental model is based on molecular biology and mass spectrometry techniques to investigate granular glands maturation process of Phyllomedusa azurea through metamorphose and the peptide skin composition when this anuran is submitted to biotic stress. The results show that larvae of P. azurea on stage 37 presents right levels of RNA transcriptions, although low concentration of peptides were identified on skin just from stage 41. There was a sudden increased peptide skin concentration when P. azurea migrates to terrestrial habitat (stage 43). But, after metamorphose end, the standard glandular peptide content of juvenile frogs is different from adult frogs. The results show that individual glands have an intrinsic peptide content stored and that the microorganisms can alter the transcriptional level processes, as well as, the peptide skin gland content. The same experimental model was applied to investigate the differential peptide expression on granular glands and inguinal macro glands from Physalaemus nattereri. The results show that the antimicrobial peptides are present on entire animal skin, while the bradykinin related peptides are present mainly on inguinal macro glands. Our finding suggest an amazing fine-tuning among animal behavior, skin physiology and gene expression. The experimental model introduced here represents an alternative strategy for differential gene expression analysis and peptide interaction identification directly on biological tissue that can be applied on different animal models.

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biologias, Programa de Pós Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-20T15:20:30Z No. of bitstreams: 1 2014_AlinedaSilvaChagas.pdf: 1323645 bytes, checksum: 96f661143e6ce644d15ed547e942f4ce (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-21T17:04:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AlinedaSilvaChagas.pdf: 1323645 bytes, checksum: 96f661143e6ce644d15ed547e942f4ce (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-21T17:04:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AlinedaSilvaChagas.pdf: 1323645 bytes, checksum: 96f661143e6ce644d15ed547e942f4ce (MD5) / A secreção cutânea de anuros é reconhecida como uma rica fonte de compostos biologicamente ativos, incluindo aminas biogênicas, alcaloides, bufadienolídeos, peptídeos e proteínas. Os peptídeos antimicrobianos constituem um sistema de defesa imediato, atuando sobre um grande espectro de mircroorganismos. A busca por novas alternativas terapêuticas no tratamento de infecções e câncer tem impulsionado nos estudos voltados à prospecção de novos peptídeos antimicrobianos. No presente trabalho, as secreções cutâneas de Leptodactylus labyrinthicus e Phyllomedusa azurea foram utilizadas para avaliar seus efeitos antiproliferativos e citotóxicos sobre células tumorais. Também foram submetidas a fracionamento cromatográfico a fim de se isolar peptídeos com atividade inibitória sobre a proliferação do fungo patogênico Candida albicans. As frações bioativas foram analisadas por MALDI-TOF MS e submetidas à recromatografia por RP-HPLC. De acordo com a estratégia experimental empregada foi possível a obtenção de duas frações homogêneas a partir da secreção de P. azurea, denominadas PaF31-7(F12) e PaF36-10(F13) que foram empregadas na determinação dos MICs para C. albicans. Tais frações mostraram-se capazes de inibir parcialmente o crescimento da levedura C. albicans na maior concentração empregada (128 µM). Também foram avaliados os efeitos citotóxicos e antiproliferativos das secreções brutas de P. azurea e L. labyrinthicus sobre as linhagens celulares HeLa, B16F10 e NIH3T3. Observou-se que a secreção bruta de L. labyrinthicus apresenta atividade antiproliferativa acentuada sobre células tumorais empregadas, especialmente células Hela, com um IC50 de 4,216 µg/mL sem apresentar citotoxicidade relevante contra células normais da linhagem NIH3T3. Ensaios adicionais de citometria de fluxo revelaram que a secreção bruta de L. labyrinthicus não interfere de forma significativa nas etapas do ciclo celular, no entanto, observa-se um aumento importante na fragmentação do DNA de células HeLa quando expostas à secreção, sugerindo que a morte celular ocorra por meio de apoptose. Mais estudos precisam ser realizados a fim de se determinar o mecanismo pelo qual a secreção bruta de L. labyrinthicus promove a morte das células tumorais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The anurans skin secretion is recognized as a rich source of active biological compounds, including alkaloids, peptides and proteins. The antimicrobial peptides constitute an immediate defense system, acting on a wide spectrum of microorganisms. The quest for new therapeutics alternatives for infections treatments and cancer have been driven studies focused on prospecting for new antimicrobial peptides. In this present work, the skin secretions by Leptodactylus labyrinthicus and Phillomedusa azurea were utilized for evaluating their antiproliferative and cytotoxic effects on tumor cells. Were also subjected the skin secretion to fractionation in order to isolate peptides with inhibitory activity on the proliferation of the pathogenic fungus Candida albicans. The bioactive fractions were analyzed by MALDI-TOF MS, and subjected to rechromatography by RP-HPLC. According to the experimental strategy used was possible to achieve two homogeneous fractions secretion from P. azurea, called PaF31 7 (F12) and PaF36 10 (F13). These fractions were capable of partially inhibiting the growth of the yeast C. albicans in greater concentration employed (128 μM). We also evaluated the cytotoxic and antiproliferative crude secretions of P. azurea and L. labyrinthicus on cell lines HeLa, NIH3T3 and B16F10 effects. It was found that the crude secretion of L. labyrinthicus shows marked antiproliferative activity on tumor cells employed, especially Hela cells with an IC50 of 4.216 μ g / ml without showing significant cytotoxicity against normal NIH3T3 cells lineage. Additional tests of flow cytometry showed that the crude secretion of L. labyrinthicus not significantly interfere with the stages of the cell cycle, however, there was a significant increase in DNA fragmentation in HeLa cells exposed to secretion, suggesting that cell death occurs by apoptosis. More studies need to be conducted to determine the mechanism by which the crude secretion of L. labyrinthicus promotes tumor cell death.