Entre os problemas fitossanitários da maçã (Malus spp) estão o superbrotamento e o lenho mole, doenças associadas a fitoplasma. Para o caso do lenho mole, ainda não é totalmente aceito que um fitoplasma seja o agente causal. No entanto, vários trabalhos, usando microscopia eletrônica e enxertia de tecidos, têm apontado para a natureza fitoplasmática da doença. Mais recentemente, um fitoplasma do grupo 16SrI foi detectado em plantas de maçã cultivadas no Canadá e na República Checa. No Brasil, o lenho mole ocorre em vários estados do sul do país, sendo que pesquisas conduzidas com microscopia eletrônica e testes biológicos de transmissão por enxertia também têm evidenciado um possível fitoplasma associado à doença. O objetivo do presente trabalho foi contribuir para o conhecimento da etiologia destas doenças. Para isto, três plantas de maçã com sintomas de lenho mole, cultivadas em pomar instalado na região de Vacaria/RS, foram amostradas visando a detecção de fitoplasma, bem como a sua identificação e posterior classificação. Para detecção, foi empregada a técnica de PCR duplo com os oligonucleotídeos R16mF2/mR1 e R16F2n/R2. A identificação foi através de PCR com os oligonucleotídeos R16(III) F2/R1 e da técnica de RFLP com as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e Sau3AI. Os resultados mostraram a presença de fitoplasma em 29 das 54 amostras coletadas durante o ano de 2000. As amostras de ramos e raízes coletadas no período de janeiro - abril e setembro - outubro apresentaram consistentemente fitoplasma em seus tecidos. Nas amostras colhidas em junho - agosto não houve detecção do microrganismo. A identificação molecular revelou que o fitoplasma presente em plantas sintomáticas pertencia ao grupo 16SrIII, sendo os resultados de PCR confirmados pela aplicação de RFLP. As análises de RFLP permitiram também determinar que este fitoplasma é, possivelmente, um membro do sub-grupo B. A constatação de um fitoplasma de grupo 16SrIII associado ao lenho mole em plantas de maçã cultivadas no Brasil, reforça as evidências relatadas em outros trabalhos, de que um fitoplasma seja o agente causal da doença. O fato de um fitoplasma diverso do grupo 16SrI estar associado ao lenho mole no Brasil pode ser justificado pela diversidade destes molicutes, em função da região geográfica e da variedade do hospedeiro. / The proliferation and rubbery wood diseases which are associated with phytoplasma are some of the diseases that occur in apple trees (Malus spp). In the case of rubbery wood disease, phytoplasm is not totally accepted as its causal agent. However, several researches by using electron microscopy and tissue grafting, have been able to show the phytoplasma associated with that disease. Recently, a phytoplasma from group 16SrI was detected in apple plants grown in Canada and Czech Republic. In Brazil, rubbery wood occurs in several states of the south region. Results obtained through electron microscopy and transmission biological tests using grafiting have shown a possible phytoplasma associated to the disease. The purpose of the present work was to contribute for the knowledge of that disease aetiology. Thus tissue samples from three apple plants exhibiting rubbery wood symptoms, grown at an orchard installed in the region of Vacaria/RS, were obtaind for phytoplasma detection, identification and classification. Nested PCR technique with R16mF2/mR1 and R16F2n/R2 primers was emploed to detect phytoplasma. PCR with R16(III) F2/R1 primers and RFLP technique with the restriction enzymes Alu I, Hha I, Kpn I, Hinf I, Hpa II, Mse I, Rsa I and Sau 3AI were used to phytoplasma indentification. The results showed that phytoplasma occurred in 29 of the 54 samples collected in the year of 2000. Branches and root samples obtained from January to April and from September to October exhibited phytoplasma in their tissues. In tissue samples collected from June to August, the microorganism has not been detected. The molecular identification revealed that the phytoplasm from symptomatic plants belonged to the group 16SrIII and the PCR results were confirmed by RFLP technique. Based upon the RFLP analyses it can be suggested that this phyoplasma is a member of the sub-group B. The occurrence of a phytoplasm of group 16SrIII associated to rubbery wood in apple plants grown in Brazil, reinforces the evidences related in other works, that a phytoplasm is the causal agent of that disease. The fact that a phytoplasm diferent from 16SrI group is associated to rubbery wood diseases in Brazil can be justified for the diversity of these mollicutes, due to geographical area and host.

Entre os problemas fitossanitários da maçã (Malus spp) estão o superbrotamento e o lenho mole, doenças associadas a fitoplasma. Para o caso do lenho mole, ainda não é totalmente aceito que um fitoplasma seja o agente causal. No entanto, vários trabalhos, usando microscopia eletrônica e enxertia de tecidos, têm apontado para a natureza fitoplasmática da doença. Mais recentemente, um fitoplasma do grupo 16SrI foi detectado em plantas de maçã cultivadas no Canadá e na República Checa. No Brasil, o lenho mole ocorre em vários estados do sul do país, sendo que pesquisas conduzidas com microscopia eletrônica e testes biológicos de transmissão por enxertia também têm evidenciado um possível fitoplasma associado à doença. O objetivo do presente trabalho foi contribuir para o conhecimento da etiologia destas doenças. Para isto, três plantas de maçã com sintomas de lenho mole, cultivadas em pomar instalado na região de Vacaria/RS, foram amostradas visando a detecção de fitoplasma, bem como a sua identificação e posterior classificação. Para detecção, foi empregada a técnica de PCR duplo com os oligonucleotídeos R16mF2/mR1 e R16F2n/R2. A identificação foi através de PCR com os oligonucleotídeos R16(III) F2/R1 e da técnica de RFLP com as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e Sau3AI. Os resultados mostraram a presença de fitoplasma em 29 das 54 amostras coletadas durante o ano de 2000. As amostras de ramos e raízes coletadas no período de janeiro – abril e setembro – outubro apresentaram consistentemente fitoplasma em seus tecidos. Nas amostras colhidas em junho – agosto não houve detecção do microrganismo. A identificação molecular revelou que o fitoplasma presente em plantas sintomáticas pertencia ao grupo 16SrIII, sendo os resultados de PCR confirmados pela aplicação de RFLP. As análises de RFLP permitiram também determinar que este fitoplasma é, possivelmente, um membro do sub-grupo B. A constatação de um fitoplasma de grupo 16SrIII associado ao lenho mole em plantas de maçã cultivadas no Brasil, reforça as evidências relatadas em outros trabalhos, de que um fitoplasma seja o agente causal da doença. O fato de um fitoplasma diverso do grupo 16SrI estar associado ao lenho mole no Brasil pode ser justificado pela diversidade destes molicutes, em função da região geográfica e da variedade do hospedeiro. / The proliferation and rubbery wood diseases which are associated with phytoplasma are some of the diseases that occur in apple trees (Malus spp). In the case of rubbery wood disease, phytoplasm is not totally accepted as its causal agent. However, several researches by using electron microscopy and tissue grafting, have been able to show the phytoplasma associated with that disease. Recently, a phytoplasma from group 16SrI was detected in apple plants grown in Canada and Czech Republic. In Brazil, rubbery wood occurs in several states of the south region. Results obtained through electron microscopy and transmission biological tests using grafiting have shown a possible phytoplasma associated to the disease. The purpose of the present work was to contribute for the knowledge of that disease aetiology. Thus tissue samples from three apple plants exhibiting rubbery wood symptoms, grown at an orchard installed in the region of Vacaria/RS, were obtaind for phytoplasma detection, identification and classification. Nested PCR technique with R16mF2/mR1 and R16F2n/R2 primers was emploed to detect phytoplasma. PCR with R16(III) F2/R1 primers and RFLP technique with the restriction enzymes Alu I, Hha I, Kpn I, Hinf I, Hpa II, Mse I, Rsa I and Sau 3AI were used to phytoplasma indentification. The results showed that phytoplasma occurred in 29 of the 54 samples collected in the year of 2000. Branches and root samples obtained from January to April and from September to October exhibited phytoplasma in their tissues. In tissue samples collected from June to August, the microorganism has not been detected. The molecular identification revealed that the phytoplasm from symptomatic plants belonged to the group 16SrIII and the PCR results were confirmed by RFLP technique. Based upon the RFLP analyses it can be suggested that this phyoplasma is a member of the sub-group B. The occurrence of a phytoplasm of group 16SrIII associated to rubbery wood in apple plants grown in Brazil, reinforces the evidences related in other works, that a phytoplasm is the causal agent of that disease. The fact that a phytoplasm diferent from 16SrI group is associated to rubbery wood diseases in Brazil can be justified for the diversity of these mollicutes, due to geographical area and host.

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo