Entre os problemas fitossanitários da maçã (Malus spp) estão o superbrotamento e o lenho mole, doenças associadas a fitoplasma. Para o caso do lenho mole, ainda não é totalmente aceito que um fitoplasma seja o agente causal. No entanto, vários trabalhos, usando microscopia eletrônica e enxertia de tecidos, têm apontado para a natureza fitoplasmática da doença. Mais recentemente, um fitoplasma do grupo 16SrI foi detectado em plantas de maçã cultivadas no Canadá e na República Checa. No Brasil, o lenho mole ocorre em vários estados do sul do país, sendo que pesquisas conduzidas com microscopia eletrônica e testes biológicos de transmissão por enxertia também têm evidenciado um possível fitoplasma associado à doença. O objetivo do presente trabalho foi contribuir para o conhecimento da etiologia destas doenças. Para isto, três plantas de maçã com sintomas de lenho mole, cultivadas em pomar instalado na região de Vacaria/RS, foram amostradas visando a detecção de fitoplasma, bem como a sua identificação e posterior classificação. Para detecção, foi empregada a técnica de PCR duplo com os oligonucleotídeos R16mF2/mR1 e R16F2n/R2. A identificação foi através de PCR com os oligonucleotídeos R16(III) F2/R1 e da técnica de RFLP com as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e Sau3AI. Os resultados mostraram a presença de fitoplasma em 29 das 54 amostras coletadas durante o ano de 2000. As amostras de ramos e raízes coletadas no período de janeiro - abril e setembro - outubro apresentaram consistentemente fitoplasma em seus tecidos. Nas amostras colhidas em junho - agosto não houve detecção do microrganismo. A identificação molecular revelou que o fitoplasma presente em plantas sintomáticas pertencia ao grupo 16SrIII, sendo os resultados de PCR confirmados pela aplicação de RFLP. As análises de RFLP permitiram também determinar que este fitoplasma é, possivelmente, um membro do sub-grupo B. A constatação de um fitoplasma de grupo 16SrIII associado ao lenho mole em plantas de maçã cultivadas no Brasil, reforça as evidências relatadas em outros trabalhos, de que um fitoplasma seja o agente causal da doença. O fato de um fitoplasma diverso do grupo 16SrI estar associado ao lenho mole no Brasil pode ser justificado pela diversidade destes molicutes, em função da região geográfica e da variedade do hospedeiro. / The proliferation and rubbery wood diseases which are associated with phytoplasma are some of the diseases that occur in apple trees (Malus spp). In the case of rubbery wood disease, phytoplasm is not totally accepted as its causal agent. However, several researches by using electron microscopy and tissue grafting, have been able to show the phytoplasma associated with that disease. Recently, a phytoplasma from group 16SrI was detected in apple plants grown in Canada and Czech Republic. In Brazil, rubbery wood occurs in several states of the south region. Results obtained through electron microscopy and transmission biological tests using grafiting have shown a possible phytoplasma associated to the disease. The purpose of the present work was to contribute for the knowledge of that disease aetiology. Thus tissue samples from three apple plants exhibiting rubbery wood symptoms, grown at an orchard installed in the region of Vacaria/RS, were obtaind for phytoplasma detection, identification and classification. Nested PCR technique with R16mF2/mR1 and R16F2n/R2 primers was emploed to detect phytoplasma. PCR with R16(III) F2/R1 primers and RFLP technique with the restriction enzymes Alu I, Hha I, Kpn I, Hinf I, Hpa II, Mse I, Rsa I and Sau 3AI were used to phytoplasma indentification. The results showed that phytoplasma occurred in 29 of the 54 samples collected in the year of 2000. Branches and root samples obtained from January to April and from September to October exhibited phytoplasma in their tissues. In tissue samples collected from June to August, the microorganism has not been detected. The molecular identification revealed that the phytoplasm from symptomatic plants belonged to the group 16SrIII and the PCR results were confirmed by RFLP technique. Based upon the RFLP analyses it can be suggested that this phyoplasma is a member of the sub-group B. The occurrence of a phytoplasm of group 16SrIII associated to rubbery wood in apple plants grown in Brazil, reinforces the evidences related in other works, that a phytoplasm is the causal agent of that disease. The fact that a phytoplasm diferent from 16SrI group is associated to rubbery wood diseases in Brazil can be justified for the diversity of these mollicutes, due to geographical area and host.

Se ha realizado una prospección en 1500 parcelas de cultivo de peral, para evaluar la extensión de la enfermedad del Decaimiento del peral (PD) en el Nordeste de España. Un 7% de las parcelas observadas presentaron síntomas de la enfermedad. Paralelamente, se ha evaluado la incidencia de la enfermedad en 45 de estas parcelas, por inspección visual de 500 árboles, en cada una de ellas. La presencia del fitoplasma fue confirmada mediante nested-PCR. Finalmente, la caracterización del fitoplasma, indicó que la enfermedad estaba causada por un único fitoplasma, el fitoplasma de PD. Se ha evaluado la expresión de síntomas de la enfermedad de PD a lo largo del año, en tres variedades distintas. Cada variedad presentó unos síntomas asociados característicos, hecho que puede ser de utilidad en nuevas prospecciones. La presencia del fitoplasma se ha examinado mediante la técnica de nested-PCR en un total de 43 árboles. En los tres casos, la máxima detección del fitoplasma fue alcanzada en Diciembre. Paralelamente, en este estudio se ha analizado qué parte de la planta (nervios, yemas o tallo) era la más adecuada para realizar una detección del fitoplasma mediante PCR. Se obtuvo la detección más fiable en tallo. Finalmente, se ha examinado el estado funcional del fitoplasma de PD durante el invierno, mediante transmisión del fitoplasma por injerto a perales sanos. Los resultados demostraron que el fitoplasma puede permanecer en estado funcional en la parte aérea del árbol durante la fase de hibernación. Se ha estudiado el papel de Cacopsylla pyri (Homoptera; psyllidae) en la transmisión del fitoplasma del Decaimiento del peral (PD) en el Nordeste de España. Los resultados obtenidos demostraron que C. pyri transmite el fitoplasma a peral y medios artificiales, y por tanto es, como en otros países del área mediterránea, vector de la enfermedad en España. Los porcentajes de psilas infectadas fueron similares entre sexos, sin embargo las hembras transmitieron el fitoplasma en mayor porcentaje que los machos. Por último, se ha puesto a punto una técnica para separar el ADN del genoma de los fitoplasmas, del de las plantas que los hospedan, gracias al alto contenido en A+T de los fitoplasmas en comparación con el de las plantas huésped. Los resultados muestran que un 90% de los clones recombinantes contenían ADN de fitoplasma. Por secuenciación y comparación con el banco de datos de NCBI fue confirmado el origen bacteriano de las secuencias, Finalmente mediante el diseño de cebadores para alguna de estas secuencias y posterior análisis por PCR se corroboró que los fragmentos de ADN clonados eran fitoplasmáticos.La técnica de dot.blot ha sido utilizada para detectar el fitoplasma del Decaimiento del peral (PD) con secuencias de ADN no ribosómicas. Para este propósito, se escogieron 2 fragmentos obtenidos a partir de la técnica anterior y fueron marcados con digoxigenina y empleados como sondas, para hibridar con extractos de ADN de perales y psilas infectados con este microorganismo. El fitoplasma de PD se detectó en ambos extractos. Se han realizado también ensayos para evaluar la sensibilidad de estas sondas en la detección del fitoplasma de PD. Para ello, se analizaron extractos de ADN de psilas, por nested-PCR e hibridación por dot.blot. Los resultados obtenidos fueron similares con ambas técnicas. Por ello, se propone la hibridación ADN / ADN como una alternativa a la PCR, Por último, el ADN de diferentes fitoplasmas, se ha utilizado para determinar si los cebadores diseñados para estos dos fragmentos eran específicos para el fitoplasma de PD, o amplificaban secuencias de otros fitoplasmas. Al obtenerse una banda específica con ADN del fitoplasma de la Proliferación del manzano (AP) y con el del PD, se confirma la relación filogenética existente entre ambos. / A total area of 1,500 Ha of commercial plots was surveyed to study the extent of pear decline disease and its relative importance in northeastern Spain. A preliminary evaluation indicated that around 7% of the plots had symptoms of the disease. At the same time, pear decline incidence (PDI) was evaluated in 45 plots. The presence of pear decline (PD) phytoplasma in these plots was confirmed by PCR amplification of phytoplasma DNA with universal or group-specific primers. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses also showed the presence of a unique phytoplasma strain.The symptom expression of PD disease in different cultivars was evaluated throughout the year. The relationship between the presence of symptoms and detection of PD by PCR in these cultivars was also studied. Results showed that the nested PCR, using specific primers to detect the DNA from PD phytoplasma, is the most accurate method to identify the total percentage of affected trees.Seasonal detection of pear decline phytoplasma was studied in 43 infected trees. The presence of the phytoplasma waa analysed by nested PCR. The three cultivars showed different pattern of detection. The maximum detection rate of pear decline phytoplasma occurred in December in the three orchards.At the same time, leaf midribs, buds and stems were compared to determine which sample was more reliable for phytoplasma detection. The best indicators were stems. The presence of phytoplasma in sieve tubes during the dormant season was determined by grafting. The results suggest that phytoplasmas could overwinter in shoots, with the implication that vegetative propagation during this period could also disseminate the disease.The frequency of Pear decline-positive insects and transmission of Pear decline (PD) phytoplasma by Cacopsylla pyri has been studied for the first time in Spain. Results indicate that the frequency of PD positive psyllids changes through the year and that C. pyri transmits the Pear decline associated disease agent in Spain. Phytoplasma transmission was also effective under laboratory conditions using a feeding medium. Although the percentage of PD positive psyllids was similar in both genders, PD phytoplasma transmission by females was significantly higher than by males. A method was developed for genome analysis of phytoplasmas, bacterial plant pathogens that cannot yet be cultivated in vitro, taking into account the different A/T content in the DNA of the pathogen and its plant host. Results showed that about 90% of recombinant clones appeared to harbour phytoplasma specific DNA inserts. Sequencing of randomly selected clones was carried out, and comparison with the NCBI database confirmed the phytoplasmatic origin. Some sequences could also be assigned a putative function. The origin of the recombinant clones was further confirmed by the generation of specific amplicons from the phytoplasma infected and not healthy plant, using PCR primers devised from the sequences of the recombinant clones. A non-isotopic hybridisation procedure was used to detect pear decline (PD) phytoplasma. Two new digoxigenin labelled DNA probes obtained from putative thymidilate kinase and peptide release genes of the PD phytoplasma were used. Hybridisations of these non-ribosomal probes with dot-blotted total nucleic acid extracts on nylon membranes allowed the detection of PD phytoplasma in infected plants and individual Cacopsylla pyri vectors. Assays to compare dot-blot hybridisation and nested-PCR procedures showed that the dot-blot hybridisation is a more reliable assay than nested-PCR. We propose the use of dot-blot hybridisation as a suitable technique for specific PD detection in epidemiological studies where there are a large number of samples to be tested.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-23Bitstream added on 2014-06-13T20:03:33Z : No. of bitstreams: 1 silveira_ft_dr_jabo.pdf: 282729 bytes, checksum: e8b76faa03114db3405ff9f319c85596 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O complexo do enfezamento, que abrange os enfezamentos pálido (Spiroplasma kunkelli) e vermelho (Mayze bushy stunt phytoplasma) é causado por patógenos pertencentes à classe dos molicutes e transmitido pela cigarrinha Dalbulus maidis. Por ser o único hospedeiro dessa doença e do seu vetor e transmissor, têm-se observado elevados prejuízos em híbridos suscetíveis. O desenvolvimento de cultivares com resistência genética é a alternativa mais eficiente para o controle dessa doença. Para isso é necessário conhecer a herança da resistência para direcionar os métodos de seleção a serem empregados e os trabalhos de introdução da resistência em germoplasmas suscetíveis. Objetivando compreender a herança da resistência aos enfezamentos em milho, foram realizados trabalhos com linhagens de milho, mediande análise dialélica e médias de gerações. Para a análise dialélica foram utilizadas doze linhagens endogâmicas de milho, representada por quatro linhagens resistentes e oito linhagens suscetíveis, cruzando-se as resistentes com as suscetíveis em esquema de dialélico parcial. Para as análises de médias de gerações foram cruzadas três linhagens resistentes e quatro suscetíveis para a obtenção das gerações F1, F2, RCP1 e RCP2. Os trabalhos foram conduzidos em Jaboticabal (SP) e Guaíra (SP), avaliando, no estádio fenológico R3, a incidência de enfezamento. Efeitos significativos para CGC e CEC foram obtidos, indicando que, no controle do caráter enfezamentos, estão envolvidos tanto os efeitos aditivos como os de dominância. Análises de médias de gerações revelaram a presença de poucos genes envolvidos com o controle da resistência, com predominância de efeitos aditivos, o que permite a seleção de genótipos resistentes. As linhagens PH1894, PH1977 e PH1173-1 poderão ser utilizadas como fontes de resistência em futuras combinações híbridas. / The corn stunt complex, that embraces the pale corn stunt (Spiroplasma kunkelli) and red (Mayze bushy stunt phytoplasma) it is caused by patógenos belonging to the class of the molicutes and transmitted by the cicada Dalbulus maidis. For being the only host of that disease and of your vector and transmitter, high damages have been observing in hybrid susceptible. The development of you cultivate with genetic resistance it is the most efficient alternative for the control of that disease. For that it is necessary to know the inheritance of the resistance to address the selection methods they be her used and the works of introduction of the resistance in susceptible germoplasmas. Aiming at to understand the inheritance of the resistance to the corn stunt, works were accomplished with corn lineages, trough analysis dialélica and averages of generations. For the analysis dialélica twelve inbred lines of corn were used, represented by four resistant inbred lines and eight susceptible inbred lines, crossing the resistant ones with the susceptible ones in outline of partial dialélico. For the analyses of averages of generation three resistant inbred lines and four were crossed susceptible for the obtaining of the generations F1, F2, RCP1 and RCP2. The works were led in Jaboticabal (SP) and Guaíra (SP), evaluating, in the stadium fenológico R3, the corn stunt incidence. Significant effects for CGC and CEC were obtained, indicating that, in the control of the character corn stunt, they are involved as much the addictive effects as the one of dominance. Analyses of averages of generations revealed the presence of few genes involved with the control of the resistance, with predominance of addictive effects, what allows the selection of resistant genotypes. The inbred lines PH1894, PH1977 and PH1173-1 can be used as resistance sources in future hybrid combinations.

Entre os problemas fitossanitários da maçã (Malus spp) estão o superbrotamento e o lenho mole, doenças associadas a fitoplasma. Para o caso do lenho mole, ainda não é totalmente aceito que um fitoplasma seja o agente causal. No entanto, vários trabalhos, usando microscopia eletrônica e enxertia de tecidos, têm apontado para a natureza fitoplasmática da doença. Mais recentemente, um fitoplasma do grupo 16SrI foi detectado em plantas de maçã cultivadas no Canadá e na República Checa. No Brasil, o lenho mole ocorre em vários estados do sul do país, sendo que pesquisas conduzidas com microscopia eletrônica e testes biológicos de transmissão por enxertia também têm evidenciado um possível fitoplasma associado à doença. O objetivo do presente trabalho foi contribuir para o conhecimento da etiologia destas doenças. Para isto, três plantas de maçã com sintomas de lenho mole, cultivadas em pomar instalado na região de Vacaria/RS, foram amostradas visando a detecção de fitoplasma, bem como a sua identificação e posterior classificação. Para detecção, foi empregada a técnica de PCR duplo com os oligonucleotídeos R16mF2/mR1 e R16F2n/R2. A identificação foi através de PCR com os oligonucleotídeos R16(III) F2/R1 e da técnica de RFLP com as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e Sau3AI. Os resultados mostraram a presença de fitoplasma em 29 das 54 amostras coletadas durante o ano de 2000. As amostras de ramos e raízes coletadas no período de janeiro – abril e setembro – outubro apresentaram consistentemente fitoplasma em seus tecidos. Nas amostras colhidas em junho – agosto não houve detecção do microrganismo. A identificação molecular revelou que o fitoplasma presente em plantas sintomáticas pertencia ao grupo 16SrIII, sendo os resultados de PCR confirmados pela aplicação de RFLP. As análises de RFLP permitiram também determinar que este fitoplasma é, possivelmente, um membro do sub-grupo B. A constatação de um fitoplasma de grupo 16SrIII associado ao lenho mole em plantas de maçã cultivadas no Brasil, reforça as evidências relatadas em outros trabalhos, de que um fitoplasma seja o agente causal da doença. O fato de um fitoplasma diverso do grupo 16SrI estar associado ao lenho mole no Brasil pode ser justificado pela diversidade destes molicutes, em função da região geográfica e da variedade do hospedeiro. / The proliferation and rubbery wood diseases which are associated with phytoplasma are some of the diseases that occur in apple trees (Malus spp). In the case of rubbery wood disease, phytoplasm is not totally accepted as its causal agent. However, several researches by using electron microscopy and tissue grafting, have been able to show the phytoplasma associated with that disease. Recently, a phytoplasma from group 16SrI was detected in apple plants grown in Canada and Czech Republic. In Brazil, rubbery wood occurs in several states of the south region. Results obtained through electron microscopy and transmission biological tests using grafiting have shown a possible phytoplasma associated to the disease. The purpose of the present work was to contribute for the knowledge of that disease aetiology. Thus tissue samples from three apple plants exhibiting rubbery wood symptoms, grown at an orchard installed in the region of Vacaria/RS, were obtaind for phytoplasma detection, identification and classification. Nested PCR technique with R16mF2/mR1 and R16F2n/R2 primers was emploed to detect phytoplasma. PCR with R16(III) F2/R1 primers and RFLP technique with the restriction enzymes Alu I, Hha I, Kpn I, Hinf I, Hpa II, Mse I, Rsa I and Sau 3AI were used to phytoplasma indentification. The results showed that phytoplasma occurred in 29 of the 54 samples collected in the year of 2000. Branches and root samples obtained from January to April and from September to October exhibited phytoplasma in their tissues. In tissue samples collected from June to August, the microorganism has not been detected. The molecular identification revealed that the phytoplasm from symptomatic plants belonged to the group 16SrIII and the PCR results were confirmed by RFLP technique. Based upon the RFLP analyses it can be suggested that this phyoplasma is a member of the sub-group B. The occurrence of a phytoplasm of group 16SrIII associated to rubbery wood in apple plants grown in Brazil, reinforces the evidences related in other works, that a phytoplasm is the causal agent of that disease. The fact that a phytoplasm diferent from 16SrI group is associated to rubbery wood diseases in Brazil can be justified for the diversity of these mollicutes, due to geographical area and host.

Fitoplasmas, procariotos sem parede celular e habitantes de floema, têm causado danos consideráveis em diversas culturas comercialmente importantes. A associação desses fitopatógenos com várias doenças que ocorrem em espécies hortícolas têm sido comumente registradas tanto no território brasileiro como em outras regiões do mundo. Em áreas de plantio comercial, na região de Piracicaba-SP e Bragança Paulista-SP, plantas de tomate e berinjela apresentando porte reduzido, clorose foliar acentuada, produção exagerada de pequenos ramos, desenvolvimento anormal do cálice, encurtamento de entre-nós, redução no tamanho de folhas, flores e frutos, que podem ser traduzidos em sintomas de enfezamento, foram observadas evidenciando infecção por fitoplasma. Através da técnica de duplo PCR utilizando os oligonucleotídeos universais R16 mF1/mR2 e R16 F2n/R2, fragmentos de DNA de 1,2 Kb foram amplificados de amostras sintomáticas, demonstrando a presença de fitoplasma nos tecidos das plantas. Nenhum fragmento foi detectado em plantas sadias. O exame de tecidos do floema de plantas sintomáticas, submetidos ao microscópio eletrônico de transmissão, revelou a presença de corpúsculos pleomórficos no interior dos vasos, corroborando com os resultados da detecção através de PCR. O uso de oligonucleotídeos específicos para identificação demonstrou a ocorrência de fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrIII, tanto em tomate quanto em berinjela. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, MseI, HpaII, KpnI, RsaI, HhaI e MboI, confirmaram a ocorrência de fitoplasmas do referido grupo em ambas as espécies vegetais. Para confirmar os resultados de RFLP, os fragmentos de DNA de 1,2 Kb dos fitoplasmas presentes em tomate e berinjela, amplificados com o par de iniciadores R16 F2n/R2, foram clonados em Escherichia coli para a determinação de suas seqüências de nucleotídeos. Os fragmentos clonados sequenciados foram comparados, por homologia de nucleotídeos, entre si e com isolados cujas seqüências já haviam sido depositadas no "GenBank". O resultado do sequenciamento revelou heterogeneidade das seqüências do gene 16S rDNA ocorrendo em alguns isolados, demonstrando e confirmando a variabilidade genética de organismos do grupo 16SrIII presentes no Brasil. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem- inhabitants. They caused considerable damages in some commercially important crops in the Brazilian territory and others regions of the world. It has been observed in the region of Piracicaba and Bragança Paulista, São Paulo State, commercial fields of eggplant and tomate showing reduced size, extensive chlorosis, proliferation of axillary buds, abnormal development of calyx, internode shortening and small leaves, flowers and fruits. These symptoms can be translated by stunting, making clear the phytoplasma infection. Presence of phytophasm was confirmed by nested PCR assay with the universal primer R16 F2N/R2 where DNA fragments of 1.2 kb were amplified from symptomatic samples. No fragments was observed in healthy plants. Analysis of symptomatic plant’s phloem tissue when submitted to electron microscope of transmission, disclosed the presence of pleomorphic bodies inside the tissues, corroborating with the results of detection by PCR assay. The use of specific primers for groups demonstrated the phytoplasmas occurrence associated to the 16SrIII group, in both tomato and eggplant. RFLP analyses using AluI, MseI, HpaII, KpnI, RsaI, HhaI and MboI restriction enzymes confirmed the occurrence of phytoplasmas on 16SrIII group in both plant species with typical stunting symptoms. The products of 1.2 kb of tomato and eggplant isolates amplified with the pair of primers R16 F2n/R2, were cloned in Escherichia coli to determine nucleotides sequence and to confirm the RFLP results. The nucleotide sequences were compared by homology and with isolates whose sequence have been already deposited in the "GenBank". The results revealed 16S rRNA sequence heterogeneity occurring in some isolates showing the genetic variability of group 16SrIII phytoplasma in Brazil.

O enfezamento vermelho do milho, causado por um fitoplasma, é uma das mais importantes doenças da cultura. Os danos ocasionados são relevantes, resultando em perdas econômicas significativas. Aspectos relacionados à interação milho-fitoplasma têm sido pouco investigados e, por consequência, são escassas as informações sobre alterações fisiológicas e bioquímicas que ocorrem no hospedeiro. O objetivo do presente trabalho foi justamente estudar as alterações bioquímicas que ocorrem em plantas de milho infectadas pelo agente causal do enfezamento vermelho. O trabalho foi desenvolvido em duas etapas. Na primeira, foram determinadas as alterações no conteúdo de proteínas e fenóis e na atividade das enzimas ß-1,3 glucanase e quitinase em nove híbridos comerciais de milho, experimentalmente inoculados com o fitoplasma. Na segunda etapa, dentre os nove híbridos, foram selecionados o mais resistente e o mais suscetível, sendo feita avaliação das alterações de proteínas, fenóis, clorofilas, açúcares redutores, peroxidase, ß-1,3 glucanase e quitinase em plantas infectadas pelo fitoplasma. Os ensaios foram conduzidos em casas teladas, sendo as plantas inoculadas aos 10 dias após a semeadura, através de 7-10 insetos infectivos da cigarrinha Dalbulus maidis por planta. A partir do aparecimento dos sintomas, amostras de folhas foram analisadas periodicamente para as determinações dos parâmetros bioquímicos. Para os nove híbridos, foi demonstrado um aumento médio de 20% no teor de proteínas, 90% de fenóis, 140% de quitinase e de 160% de ß-1,3 glucanase, em plantas inoculadas. Nos ensaios com os híbridos resistente e suscetível inoculados, os resultados mostraram que houve um aumento em todos os parâmetros bioquímicos avaliados, exceção feita à clorofila, cujo teor foi reduzido em função da infecção pelo patógeno. De modo geral, os valores obtidos para os diferentes parâmetros foram mais elevados no híbrido suscetível quando comparados ao híbrido resistente. O aumento das concentrações de proteínas, açúcares redutores e fenóis em plantas inoculadas revela alteração nos processos metabólicos do hospedeiro decorrentes da infecção pelo patógeno. Alterações nas atividades enzimáticas parecem fazer parte de uma resposta inespecífica de defesa. A redução na quantidade de clorofila total indica que o fitoplasma pode interferir no mecanismo fotossintético, podendo levar ao aceleramento do processo de senescência foliar. / Maize bushy stunt , caused by a phytoplasma, is an important disease of corn crop. The damages are relevant, resulting in significant economic losses. Aspects related to corn-phytoplasma interaction has been little investigated and consequently information about physiological and biochemical alterations that occur in the host are rare. Thus, the objective of the present work was to study biochemical alterations that occur in corn plants infected by the maize bushy stunt phytoplasma. The work was carried out on two steps. First, using 9 commercial hybrids, alterations in the levels of protein and phenol and in the activities of the enzymes b-1,3 glucanase and chitinase, in plants inoculated with the phytoplasma were determinated. In the second step, among the 9 hybrids the most resistant and the most susceptible one was selected and changes in protein, phenol, clorophyl, reducing sugar, peroxidase, b-1,3 glucanase and chitinase in infected plants. were evaluated. The experiments were carried out inside greenhouse, and the corn plants were inoculated by using infective Dalbulus maidis leafhoppers 10 days after seeding. When symptoms started to appear, leaf samples were harvested at different times for the biochemical analyses. It was shown an average increase of 20% in protein and 90% in phenol content and increases around 140% and 160% in the activities of chitinases and b-1,3-glucanases, respectively, in all 9 hybrids tested. When only the most susceptible and resistant hybrids were inoculated, the results showed an increase in all biochemical parameters evaluated, with exception for the chlorophyll content that decreased. In a general way, the values observed for the compounds and enzyme activities were higher in the susceptible hybrid when compared to the resistant one. The increases in protein, reducing sugar and phenol contents in inoculated plants point out changes in host metabolism due to the phytoplasma. The changes in enzyme activity seems to be an unspecific response of the plant to the pathogen and the reduction in chlorophyll content shows that the phytoplasma can interfere in photosynthesis and perhaps speedy senescence in the leaf tissue.

A cultura da ameixeira vem despertando a atenção de produtores brasileiros, pois oferece alta rentabilidade, possibilita a prática da agricultura familiar, emprega mão de obra, recebe incentivos de programas oficiais e conta com um mercado altamente promissor. No entanto, a cultura ainda necessita de cultivares com melhor adaptação climática, qualidade de frutos e resistência às doenças. Atualmente, dentre as doenças, o \"amarelo das fruteiras de caroço\", associada a um fitoplasma, vem causando sérios problemas. Em 2013, em pomares comercias de ameixeira (Prunus salicina), instalados em Paranapanema (SP), foram observadas plantas portadoras de sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por superbrotamento de ramos, redução no comprimento de entrenós, além de amarelecimento, deformação e redução do tamanho de folhas. Nestas plantas foi identificado um fitoplasma pertencente ao grupo 16SrI-B (Candidatus Phytoplasma asteris). Visando aumentar os conhecimentos sobre este patossistema, o objetivo desse trabalho foi estudar a dinâmica da colonização de plantas comerciais de ameixa infectadas pelo fitoplasma. Para isso, em dois pomares, amostras da parte aérea e raiz de plantas sintomáticas, pertencentes às variedades Gulfblaze e Azteca, foram coletadas mensalmente, durante um ano. O DNA total foi extraído e submetido ao PCR em tempo real para quantificar o fitoplasma nos tecidos do hospedeiro. Nessas reações foram utilizados os iniciadores universais UniRNAForward/UniRNAReverse. O fitoplasma foi detectado em todas as amostras, tanto aquelas da parte aérea quanto de raízes, em ambas as variedades estudadas. A concentração do patógeno nos tecidos do hospedeiro variou de 5,3 x 103 a 4,54 x 106 e 3,28 x 103 a 1,28 x 106 número de cópias/100ng de DNA total, na parte aérea e nas raízes, respectivamente. Os resultados mostraram uma flutuação sazonal na concentração do fitoplasma, onde as maiores concentrações foram encontradas nas épocas mais quentes do ano, principalmente no mês de dezembro, e uma redução na concentração do patógeno foi observada nas épocas mais frias, embora o fitoplasma tenha permanecido na parte aérea da planta durante a fase de dormência do hospedeiro. A variedade Gulfblaze apresentou maior concentração do patógeno comparada com a variedade Azteca. O fitoplasma associado ao amarelo da ameixeira também foi encontrado em maior concentração na copa da planta. Com base nos resultados, amostras retiradas da parte aérea e nas épocas mais quentes do ano são as mais indicadas para os procedimentos de detecção do patógeno, visando uma diagnose mais confiável. / Plum is a crop that has aroused the attention of Brazilian growers due to high profitability, family farming, incentive arrangement and promising market. However the plum culture still need of varieties with good climate adaptation, best quality fruit, and disease resistance. Currently, among the diseases, stone fruit yellows, associated with a phytoplasma have caused serious problems. In 2013, in commercial orchards of plum (Prunus salicina) located in Paranapanema (SP), plants were observed exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by witches broom and shortened internodes. Besides, the leaves were yellowish, malformed, and reduced in size. In these plants was identified a phytoplasma belonging to the group 16SrI-B (Candidatus Phytoplasma asteris). The aim of the present work was to study the dynamics of colonization of commercial plants plum by the phytoplasma, in order to better understanding of the disease. Thus, in two orchards, samples from aerial parts and roots of symptomatic plants belonging to Gulfblaze and Azteca varieties were collected monthly, during a year. Total DNA was extracted and submitted to the Real Time PCR to quantify the phytoplasma in host tissues. In these reactions the universal primers UniRNAForward/UniRNAReverse were used. The phytoplasma was detected in all samples, both aerial parts and roots of the two varieties. The concentration of the pathogen in host tissues ranged from 5,3 x 103 to 4,54 x 106 and 3,28 x 103 to 1,28 x 106 number of copies/100 ng of total DNA in aerial parts and roots, respectively. The results showed a seasonal fluctuation in the concentration of phytoplasma. The highest concentrations were found in the warmer seasons of the year, especially in December, and a reduction in pathogen concentration was observed when the weather was milder, although the phytoplasma remained in aerial part of the plant during the dormant phase of the host. The Gulfblaze variety showed a higher concentration of the pathogen compared with the Azteca variety. In addition, the phytoplasma associated with the disease was found in highest concentration in the aerial part of plant. Based on the results, samples collected from the aerial part and in the warmer seasons of the year are the most recommended for pathogen detection procedures for safe diagnosis.

O melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L) é uma cucurbitácea que ocorre em todas as regiões geográficas brasileiras. A espécie apresenta duas \"variedades\" distintas, comumente conhecidas por \"variedade silvestre\" e \"variedade cultivada\", esta última caracterizada por plantas de maior tamanho. Plantas da \"variedade selvagem\" são hospedeiras de um fitoplasma do grupo 16SrIII-J, que causa superbrotamento de ramos, nanismo generalizado, clorose, redução no tamanho de folhas e frutos. No entanto, não há informação da \"variedade cultivada\" ser hospedeira de fitoplasmas. Assim, no presente estudo, plantas sintomáticas desta \"variedade\" foram analisadas quanto à presença de fitoplasmas em seus tecidos, visando associar este tipo de patógeno à doença. Neste mesmo trabalho, os isolados do fitoplasma encontrados nas plantas sintomáticas da \"variedade cultivada\" foram molecularmente analisados em relação ao gene secY, atualmente usado como um marcador que permite identificar variações genéticas sutis. Buscou-se, com isto, identificar possíveis variantes entre os isolados. Amplificações de fragmentos de DNA a partir dos genes 16S rRNA (1,2Kb) e secY (1,6Kb) demonstraram a associação de fitoplasma do grupo 16SrIII com as plantas sintomáticas de melão-de-São-Caetano da \"variedade cultivada\". Nestas plantas, corpúsculos pleomórficos, típicos de fitoplasmas, foram visualizados no floema dos tecidos doentes, confirmando os resultados dos testes moleculares. Análises de RFLP virtual, conduzidas com o fragmento genômico correspondente ao gene secY e diversas enzimas de restrição, permitiram identificar o referido fitoplasma como pertencente ao subgrupo 16SrIIIJ. A análise filogenética evidenciou que o fitoplasma padrão do subgrupo 16SrIII-J emergiu do mesmo ramo que o fitoplasma identificado no melão-de-São-Caetano, confirmando que ambos estão estritamente relacionados. O emprego do gene secY como marcador para diferenciação fina entre fitoplasmas não apontou variabilidade genética entre os isolados do fitoplasma detectado tanto nas plantas da \"variedade cultivada\" como naquelas pertencentes à \"variedade selvagem\". Como conclusão, a \"variedade cultivada\" de M. charantia é hospedeira do mesmo fitoplasma encontrado na \"variedade selvagem\", o qual é afiliado ao subgrupo 16SrIII-J; por sua vez, o gene seY não distinguiu geneticamente os isolados do fitoplasma pertencente ao subgrupo 16SrIII-J, presentes nas plantas de melão-de-São- Caetano. / Momordica charantia is a species of the family Cucurbitaceae that occurs in all Brazilian geographic regions. This species presents two distinct \"varieties\", commonly called \"wild variety\" and \"cultivated variety\", whose plants are bigger than those belonging to the \"wild variety\". Plants of the \"wild variety\" are hosts of a phytoplasma of the group 16SrIII-J, which is associated with shoot proliferation, stunting, chlorosis, and small leaves and fruits. However, there is no information about the occurrence of phytoplasmas in plants of the \"cultivated variety\". Thus, in the present study, symptomatic plants belonging to this \"variety\" were analysed in order to associate phytoplasmas with the disease. In addition, strains of the phytoplasma found in symptomatic plants of the \"cultivated variety\" were molecularly analyzed in relation to the gene secY, which is currently used as a marker for identification fine of genetic diversity, aiming provide elements for construction of new schemes for classification of phytoplasmas. The objective was to identify distinct strains among the strains present in plants of the wild and cultivated varieties. Amplifications of DNA fragments from the genes 16Sr rRNA (1.2Kb) and secY (1.6Kb) demonstrated the association of a phytoplasma of group 16SrIII with the symptomatic plants belonging to \"cultivated variety\". These plants revealed the presence of pleomorphic bodies, typical of phytoplasmas, which was visualized in the phloem vessel from diseased tissues, confirming the results obtained by molecular assays. Virtual RFLP analysis, performed with the genomic fragment corresponding to the gene secY and various restriction enzymes, allowed to identify this phytoplasma as a member of the subgroup 16SrIII-J. Phylogenetic analysis revealed that the phytoplasma used as reference for 16SrIII-J subgroup and the phytoplasma identified in plants of M. charantia emerged from the same branch, confirming that both phytoplasmas are closely related. The gene secY, used as marker for fine differentiation of phythoplasmas, did not show genetic variability among the strains of the phytoplasma detected both plants belonging to \"cultivated variety\" and \"wild variety\". In conclusion, plants of the \"cultivated variety\" are hosts of the same phytoplasma found in the \"wild variety, which is affiliated with the 16SrIII-J subgroup; in addition, the gene secY did not distinguish isolates of the phytoplasma belonging to 16SrIII-J subgroup, present in plants of M. charantia.

Fitoplasmas, procariotos sem parede celular e habitantes de floema, têm causado danos consideráveis em diversas culturas comercialmente importantes. A associação desses fitopatógenos com várias doenças que ocorrem em espécies hortícolas têm sido comumente registradas tanto no território brasileiro como em outras regiões do mundo. Em áreas de plantio comercial, na região de Piracicaba-SP e Bragança Paulista-SP, plantas de tomate e berinjela apresentando porte reduzido, clorose foliar acentuada, produção exagerada de pequenos ramos, desenvolvimento anormal do cálice, encurtamento de entre-nós, redução no tamanho de folhas, flores e frutos, que podem ser traduzidos em sintomas de enfezamento, foram observadas evidenciando infecção por fitoplasma. Através da técnica de duplo PCR utilizando os oligonucleotídeos universais R16 mF1/mR2 e R16 F2n/R2, fragmentos de DNA de 1,2 Kb foram amplificados de amostras sintomáticas, demonstrando a presença de fitoplasma nos tecidos das plantas. Nenhum fragmento foi detectado em plantas sadias. O exame de tecidos do floema de plantas sintomáticas, submetidos ao microscópio eletrônico de transmissão, revelou a presença de corpúsculos pleomórficos no interior dos vasos, corroborando com os resultados da detecção através de PCR. O uso de oligonucleotídeos específicos para identificação demonstrou a ocorrência de fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrIII, tanto em tomate quanto em berinjela. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, MseI, HpaII, KpnI, RsaI, HhaI e MboI, confirmaram a ocorrência de fitoplasmas do referido grupo em ambas as espécies vegetais. Para confirmar os resultados de RFLP, os fragmentos de DNA de 1,2 Kb dos fitoplasmas presentes em tomate e berinjela, amplificados com o par de iniciadores R16 F2n/R2, foram clonados em Escherichia coli para a determinação de suas seqüências de nucleotídeos. Os fragmentos clonados sequenciados foram comparados, por homologia de nucleotídeos, entre si e com isolados cujas seqüências já haviam sido depositadas no “GenBank”. O resultado do sequenciamento revelou heterogeneidade das seqüências do gene 16S rDNA ocorrendo em alguns isolados, demonstrando e confirmando a variabilidade genética de organismos do grupo 16SrIII presentes no Brasil. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem- inhabitants. They caused considerable damages in some commercially important crops in the Brazilian territory and others regions of the world. It has been observed in the region of Piracicaba and Bragança Paulista, São Paulo State, commercial fields of eggplant and tomate showing reduced size, extensive chlorosis, proliferation of axillary buds, abnormal development of calyx, internode shortening and small leaves, flowers and fruits. These symptoms can be translated by stunting, making clear the phytoplasma infection. Presence of phytophasm was confirmed by nested PCR assay with the universal primer R16 F2N/R2 where DNA fragments of 1.2 kb were amplified from symptomatic samples. No fragments was observed in healthy plants. Analysis of symptomatic plant’s phloem tissue when submitted to electron microscope of transmission, disclosed the presence of pleomorphic bodies inside the tissues, corroborating with the results of detection by PCR assay. The use of specific primers for groups demonstrated the phytoplasmas occurrence associated to the 16SrIII group, in both tomato and eggplant. RFLP analyses using AluI, MseI, HpaII, KpnI, RsaI, HhaI and MboI restriction enzymes confirmed the occurrence of phytoplasmas on 16SrIII group in both plant species with typical stunting symptoms. The products of 1.2 kb of tomato and eggplant isolates amplified with the pair of primers R16 F2n/R2, were cloned in Escherichia coli to determine nucleotides sequence and to confirm the RFLP results. The nucleotide sequences were compared by homology and with isolates whose sequence have been already deposited in the “GenBank”. The results revealed 16S rRNA sequence heterogeneity occurring in some isolates showing the genetic variability of group 16SrIII phytoplasma in Brazil.

O melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L) é uma cucurbitácea que ocorre em todas as regiões geográficas brasileiras. A espécie apresenta duas \"variedades\" distintas, comumente conhecidas por \"variedade silvestre\" e \"variedade cultivada\", esta última caracterizada por plantas de maior tamanho. Plantas da \"variedade selvagem\" são hospedeiras de um fitoplasma do grupo 16SrIII-J, que causa superbrotamento de ramos, nanismo generalizado, clorose, redução no tamanho de folhas e frutos. No entanto, não há informação da \"variedade cultivada\" ser hospedeira de fitoplasmas. Assim, no presente estudo, plantas sintomáticas desta \"variedade\" foram analisadas quanto à presença de fitoplasmas em seus tecidos, visando associar este tipo de patógeno à doença. Neste mesmo trabalho, os isolados do fitoplasma encontrados nas plantas sintomáticas da \"variedade cultivada\" foram molecularmente analisados em relação ao gene secY, atualmente usado como um marcador que permite identificar variações genéticas sutis. Buscou-se, com isto, identificar possíveis variantes entre os isolados. Amplificações de fragmentos de DNA a partir dos genes 16S rRNA (1,2Kb) e secY (1,6Kb) demonstraram a associação de fitoplasma do grupo 16SrIII com as plantas sintomáticas de melão-de-São-Caetano da \"variedade cultivada\". Nestas plantas, corpúsculos pleomórficos, típicos de fitoplasmas, foram visualizados no floema dos tecidos doentes, confirmando os resultados dos testes moleculares. Análises de RFLP virtual, conduzidas com o fragmento genômico correspondente ao gene secY e diversas enzimas de restrição, permitiram identificar o referido fitoplasma como pertencente ao subgrupo 16SrIIIJ. A análise filogenética evidenciou que o fitoplasma padrão do subgrupo 16SrIII-J emergiu do mesmo ramo que o fitoplasma identificado no melão-de-São-Caetano, confirmando que ambos estão estritamente relacionados. O emprego do gene secY como marcador para diferenciação fina entre fitoplasmas não apontou variabilidade genética entre os isolados do fitoplasma detectado tanto nas plantas da \"variedade cultivada\" como naquelas pertencentes à \"variedade selvagem\". Como conclusão, a \"variedade cultivada\" de M. charantia é hospedeira do mesmo fitoplasma encontrado na \"variedade selvagem\", o qual é afiliado ao subgrupo 16SrIII-J; por sua vez, o gene seY não distinguiu geneticamente os isolados do fitoplasma pertencente ao subgrupo 16SrIII-J, presentes nas plantas de melão-de-São- Caetano. / Momordica charantia is a species of the family Cucurbitaceae that occurs in all Brazilian geographic regions. This species presents two distinct \"varieties\", commonly called \"wild variety\" and \"cultivated variety\", whose plants are bigger than those belonging to the \"wild variety\". Plants of the \"wild variety\" are hosts of a phytoplasma of the group 16SrIII-J, which is associated with shoot proliferation, stunting, chlorosis, and small leaves and fruits. However, there is no information about the occurrence of phytoplasmas in plants of the \"cultivated variety\". Thus, in the present study, symptomatic plants belonging to this \"variety\" were analysed in order to associate phytoplasmas with the disease. In addition, strains of the phytoplasma found in symptomatic plants of the \"cultivated variety\" were molecularly analyzed in relation to the gene secY, which is currently used as a marker for identification fine of genetic diversity, aiming provide elements for construction of new schemes for classification of phytoplasmas. The objective was to identify distinct strains among the strains present in plants of the wild and cultivated varieties. Amplifications of DNA fragments from the genes 16Sr rRNA (1.2Kb) and secY (1.6Kb) demonstrated the association of a phytoplasma of group 16SrIII with the symptomatic plants belonging to \"cultivated variety\". These plants revealed the presence of pleomorphic bodies, typical of phytoplasmas, which was visualized in the phloem vessel from diseased tissues, confirming the results obtained by molecular assays. Virtual RFLP analysis, performed with the genomic fragment corresponding to the gene secY and various restriction enzymes, allowed to identify this phytoplasma as a member of the subgroup 16SrIII-J. Phylogenetic analysis revealed that the phytoplasma used as reference for 16SrIII-J subgroup and the phytoplasma identified in plants of M. charantia emerged from the same branch, confirming that both phytoplasmas are closely related. The gene secY, used as marker for fine differentiation of phythoplasmas, did not show genetic variability among the strains of the phytoplasma detected both plants belonging to \"cultivated variety\" and \"wild variety\". In conclusion, plants of the \"cultivated variety\" are hosts of the same phytoplasma found in the \"wild variety, which is affiliated with the 16SrIII-J subgroup; in addition, the gene secY did not distinguish isolates of the phytoplasma belonging to 16SrIII-J subgroup, present in plants of M. charantia.