Regensburg, Univ., Diss., 2008.

The neuropeptide pigment-dispersing factor (PDF) is a key player to orchestrate the central clock of Drosophila melanogaster. In the fly brain PDF is expressed by the ventral lateral neurons which are the central pacemakers of the Drosophila circadian system and therefore align different clock neurons and modulate downstream circuits. The terminals of the small ventral lateral neurons (s-LNv) undergo daily circadian morphological changes which also affects the synaptic organization of these neurons. However, PDF function and release seems to be unaffected by the circadian plasticity. In Drosophila presynaptic sites are organized by the active zone protein Bruchpilot (BRP), a homolog of the mammalian ELKS protein. BRP and other active zone scaffold proteins are crucial for the recruiting and membrane fusion of small synaptic vesicles that contain amino-acid or monoamide transmitters. Neuropeptides, like PDF, are produced from larger preproproteins within the regulated secretory pathway. The preproproteins are directed to the lumen of the rough endoplasmic reticulum where, after removal of the signal peptide, the resulting proprotein can be modified and is then exported to the trans-Golgi network. Finally, the proproteins are packaged within dense-core vesicles (DCV) and transported to release sites. Within the trans-Golgi and the dense-core vesicles, the bioactive peptides are processed from the proprotein by a set of specific enzymes. Neuropeptide release sites seem to be non-correlated to active zones (AZ), indicating an independence of PDF release from synaptic scaffold proteins. This study aims to elucidate the relevance of AZ for the release of neuropeptides, especially for PDF, by taking both anatomical and functional aspects into consideration. I employed endogenous BRP labeling to examine the spatial correlation between immunolabeled PDF-containing DCV and BRP-labeled AZs in the s-LNv. The number of BRP-labeled puncta in the s-LNv terminals remained stable between morning (Zeitgeber time 2) and night (Zeitgeber time 14) but the puncta-density changed during circadian plasticity. This is an indicator for recycling of BRP in the s-LNv terminals. The relative distance between BRP- and PDF-labeled puncta was higher in the morning, around the reported time of PDF release. This is also the time of day when the terminal arborization complexity is most prominent. Investigation of the publically available ssTEM dataset (FAFB) suggests that spontaneous DCV release profiles in the s-LNv lacked spatial correlation to BRP-organized AZs (T-bars). Functional impairment of PDF signaling via RNAi expression in the sLNvs leads to a shift of circadian locomotor activity and a weaker rhythmicity under constant darkness. Both were not affected by downregulation of brp in the s-LNvs. However, the knockdown of the peptide release factor cadps or proteins involved in the SNARE complex significantly impaired rhythmic strength. To further investigate the impact of brp knockdown in DCV release, I employed another RNAi screen in the Inka cells, which produce the ecdysis triggering hormone (ETH). Knockdown of eth, cadps and SNARE proteins led to severely impaired behaviour, while knockdown of brp and other AZ scaffold proteins did not phenocopy the impairment of ETH signaling. Taken together, the data collected in this study suggest that DCV release of PDF and ETH is independent of BRP-organized AZs, supporting the hypothesis of different release processes for neuropeptides and classical neurotransmitters. Further investigations are necessary to elucidate the recruitment and targeting of DCV release. Anatomical investigation of CNS in the Drosophila brain proves challenging for structures that are as tiny as ACs since their size lies beyond the diffraction limit of light. Many studies employ electron microscopy (EM) to visualize structures in the scale of nanometers. However, fixation methods for EM reduce the toolset for immunostaining methods because epitopes, neccessary to identify the regions of interests (ROIs) in histology samples are blocked or denaturated. Correlative light and electron microscopy (CLEM) offer a solution to this dilemma by combining the best of both worlds. In this study I adjusted a protocol, which was originally published for C. elegans to Drosophila brain-tissue samples. I was able to label PDF immunostained on serial plastic sections and reconstruct a ROI with a z-resolution of 100nm. / Das Neuropeptid Pigment-Dispersing Factor (PDF) spielt eine Schlüsselrolle bei der Steuerung der zentralen Uhr von Drosophila melanogaster. Im Fliegenhirn wird PDF von den ventralen lateralen Neuronen exprimiert, welche die zentralen Schrittmacher des zirkadianen Systems von Drosophila sind und daher verschiedene Uhrneuronen synchronisieren und nachgeschaltete Schaltkreise modulieren. Die Endigungen der kleinen ventrolateralen Neuronen (s-LNv) unterliegen täglichen zirkadianen morpho- logischen Veränderungen, welche auch die synaptische Organisation dieser Neuronen beeinflussen. Die Funktion und Freisetzung von PDF scheint jedoch von der zirka- dianen Plastizität unbeeinflusst zu sein. In Drosophila werden präsynaptische Stel- len durch das aktive Zonen Protein Bruchpilot (BRP), einem Homolog des ELKS- Proteins der Säugetiere, organisiert. BRP und andere Gerüstproteine der aktiven Zone sind entscheidend für die Rekrutierung und Membranfusion kleiner synapti- scher Vesikel, die Aminosäure- oder Monoamid-Transmitter enthalten. Neuropeptide werden wie PDF aus größeren Präproproteinen im Rahmen des re- gulierten Sekretionsweges hergestellt. Die Präproproteine werden in das Lumen des rauen Endoplasmatischen Retikulums (ER) geleitet, wo das resultierende Proprotein nach Entfernung des Signalpeptids modifiziert werden kann und dann in das trans- Golgi-Netzwerk exportiert wird. Schließlich werden die Proproteine in Dense-Core- Vesikel (DCV) verpackt und zu den Stellen, an denen sie freigesetzt werden, trans- portiert. Innerhalb des trans-Golgi-Netzwerks und der ”dense-core-vesicles”(DCVs) werden die bioaktiven Peptide durch eine Reihe spezifischer Enzyme aus dem Pro- protein prozessiert. Freisetzungsstellen für Neuropeptide scheinen nicht mit akti- ven Zonen (AZ) zu korrelieren, was auf eine Unabhängigkeit der PDF-Freisetzung von synaptischen Gerüstproteinen hinweist. Ziel dieser Studie war es, die Bedeu- tung der AZ für die Freisetzung von Neuropeptiden, insbesondere von PDF, unter Berücksichtigung sowohl anatomischer als auch funktioneller Aspekte aufzuzeigen. Um die räumliche Korrelation zwischen immunmarkierten PDF-haltigen DCVs und BRP-markierten AZs in s-LNvs zu untersuchen, nutzte ich endogene BRP-Markierung. Die Anzahl der BRP Punkte in den s-LNv-Endigungen blieb zwischen Morgen (Zeit- geberzeit 2) und Nacht (Zeitgeberzeit 14) stabil, aber die Punktdichte veränderte sich während der zirkadianen Plastizität. Dies ist ein Indikator für das Recycling von BRP in den s-LNv Endigungen. Der relative Abstand zwischen BRP- und PDF- markierten Punkten war am Morgen größer, etwa zum angegebenen Zeitpunkt der PDF-Freisetzung. Dies ist auch die Tageszeit, zu der die Komplexität der Endigungs- verzweigung am stärksten ausgeprägt ist. Die Untersuchung des frei zugänglichen ssTEM-Datensatzes (FAFB) deutet darauf hin, dass die Profile der spontanen DCV- Freisetzung im s-LNv keine räumliche Korrelation zu den durch BRP organisierten aktiven Zonen (T-Bars) aufweisen. Eine funktionelle Beeinträchtigung der PDF- Signalübertragung durch RNAi-Expression in den s-LNvs führt zu einer Verschie- bung der zirkadianen Bewegungsaktivität und einer schwächeren Rhythmik bei kon- stanter Dunkelheit. Beides wurde durch die Herunterregulierung von brp in den s- LNvs nicht beeinflusst. Die Deaktivierung des Peptidfreisetzungsfaktors Cadps oder von Proteinen, die am SNARE-Komplex beteiligt sind, beeinträchtigte die rhythmi- sche Stärke jedoch signifikant. Um die Auswirkungen der Ausschaltung von brp auf die DCV-Freisetzung weiter zu untersuchen führte ich einen weiteren RNAi-Screen in den Inka-Zellen durch, die das Ecdysis triggering hormone (ETH) produzieren. Die Ausschaltung von ETH, CADPS und SNARE-Proteinen führte zu einer starken Beeinträchtigung des Schlupfverhaltens, während die Ausschaltung von BRP und anderen Gerüstproteinen der AZ den ETH-defizitären Phänotyp nicht kopierte. Insgesamt deuten die in dieser Studie gesammelten Daten darauf hin, dass die DCV- Freisetzung von PDF und ETH unabhängig von BRP-organisierten AZs stattfindet, was die Hypothese unterschiedlicher Freisetzungsprozesse für Neuropeptide und klas- sische Neurotransmitter stützt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Rekru- tierung und das Targeting der DCV-Freisetzung zu klären. Die anatomische Untersuchung des ZNS im Drosophila-Gehirn erweist sich bei so winzigen Strukturen wie den AZs als schwierig, da ihre Größe jenseits der Beugungs- grenze des Lichts liegt. Viele Studien nutzen die Elektronenmikroskopie (EM), um Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu machen. Die Fixierungsmethoden für die EM schränken jedoch das Instrumentarium für Immunfärbemethoden ein, da Epitope, die zur Identifizierung der relevanten Regionen (ROIs) in histologischen Proben notwendig sind, blockiert oder denaturiert werden. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) bieten eine Lösung für dieses Dilemma, indem sie das Beste aus beiden Welten kombinieren. In dieser Studie habe ich ein Protokoll, das ursprünglich für C. elegans veröffentlicht wurde, an Drosophila-Gehirngewebeproben angepasst. Ich konnte PDF-Immunfärbungen auf seriellen Plastikschnitten markie- ren und eine ROI mit einer z-Auflösung von 100 nm rekonstruieren

Endogenous clocks regulate physiological as well as behavioral rhythms within all organisms. They are well investigated in D. melanogaster on a molecular as well as anatomical level. The neuronal clock network within the brain represents the center for rhythmic activity control. One neuronal clock subgroup, the pigment dispersing factor (PDF) neurons, stands out for its importance in regulating rhythmic behavior. These neurons express the neuropeptide PDF (pigment dispersing factor). A small neuropil at the medulla’s edge, the accessory medulla (AME), is of special interest, as it has been determined as the main center for clock control. It is not only highly innervated by the PDF neurons but also by terminals of all other clock neuron subgroups. Furthermore, terminals of the photoreceptors provide light information to the AME. Many different types of neurons converge within the AME and afterward spread to their next target. Thereby the AME is supplied with information from a variety of brain regions. Among these neurons are the aminergic ones whose receptors’ are expressed in the PDF neurons. The present study sheds light onto putative synaptic partners and anatomical arrangements within the neuronal clock network, especially within the AME, as such knowledge is a prerequisite to understand circadian behavior. The aminergic neurons’ conspicuous vicinity to the PDF neurons suggests synaptic communication among them. Thus, based on former anatomical studies regarding this issue detailed light microscopic studies have been performed. Double immunolabellings, analyses of the spatial relation of pre- and postsynaptic sites of the individual neuron populations with respect to each other and the identification of putative synaptic partners using GRASP reenforce the hypothesis of synaptic interactions within the AME between dopaminergic/ serotonergic neurons and the PDF neurons. To shed light on the synaptic partners I performed first steps in array tomography, as it allows terrific informative analyses of fluorescent signals on an ultrastructural level. Therefore, I tested different ways of sample preparation in order to achieve and optimize fluorescent signals on 100 nm thin tissue sections and I made overlays with electron microscopic images. Furthermore, I made assumptions about synaptic modulations within the neuronal clock network via glial cells. I detected their cell bodies in close vicinity to the AME and PDFcontaining clock neurons. It has already been shown that glial cells modulate the release of PDF from s-LNvs’ terminals within the dorsal brain. On an anatomical level this modulation appears to exist also within the AME, as synaptic contacts that involve PDF-positive dendritic terminals are embedded into glial fibers. Intriguingly, these postsynaptic PDF fibers are often VIIAbstract part of dyadic or even multiple-contact sites in opposite to prolonged presynaptic active zonesimplicating complex neuronal interactions within the AME. To unravel possible mechanisms of such synaptic arrangements, I tried to localize the ABC transporter White. Its presence within glial cells would indicate a recycling mechanism of transmitted amines which allows their fast re-provision. Taken together, synapses accompanied by glial cells appear to be a common arrangement within the AME to regulate circadian behavior. The complexity of mechanisms that contribute in modulation of circadian information is reflected by the complex diversity of synaptic arrangements that involves obviously several types of neuron populations / Endogene Uhren steuern sowohl physiologische als auch verhaltensbedingte Rhythmen bei allen Organismen. In D. melanogaster sind sie nicht nur auf molekularer sondern auch auf anatomischer Ebene bereits gut erforscht. Das neuronale Uhrnetzwerk im Gehirn stellt das Zentrum der Steuerung der rhythmischen Aktivität dar. Eine Uhrneuronengruppe sticht allein schon durch ihre besonderen anatomischen Eigenschaften hervor. Diese Neurone exprimieren das Neuropeptid PDF (pigment dispersing factor), welches zudem besonderen Einfluss auf die Lokomotionsaktivität der Fliege hat. Ein kleines Neuropil am Rande der Medulla, die akzessorische Medulla (AME) ist von besonderem Interesse, da neben seiner intensiven Innervation durch die PDF-Neurone auch Terminale aller anderen Uhrneuronengruppen zu finden sind. Zudem wird sie durch Terminale der Photorezeptoren mit Informatonen über die Lichtverhätnisse versorgt. Die AME erreichen des Weiteren Informationen aus vielen anderen Hirnregionen. Eine Vielzahl von Neuronentypen laufen in ihr zusammen, um sich anschließend wieder in verschiedenste Hirnareale zu verteilen. So wird die AME auch durchzogen von Fasern mit aminergem Inhalt, dessen Rezeptoren wiederum auf den PDF-Neuronen zu finden sind. Die vorliegende Arbeit gibt Aufschluss über vermutliche synaptische Partner und anatomische Anordnungen innerhalb des neuronalen Uhrnetzwerkes, insbesondere innerhalb der AME. Solch Wissen stellt eine Grundvoraussetzung dar, um zirkadianes Verhalten verstehen zu können. Die auffällige Nähe der aminergen Neurone zu den PDF Neuronen lässt eine synaptische Interaktion zwischen ihnen vermuten. Deshalb wurden basierend auf vorangegangen Studien detailiertere Untersuchungen dieser Thematik durchgeführt. So wird die Hypothese über synaptische Interaktionen innerhalb der AME zwischen dopaminergen/ serotonergen Neuronen und den PDF Neuronen bestärkt mittels Doppelimmunofärbungen, gegenüberstellende Analysen über die räumlichen Nähe von prä- und postsynaptischen Stellen der jeweiligen Neuronenpopulationen und durch die Identifikation vermutlicher synaptischer Partner unter Verwendung von GRASP. Zur möglichen Identifikation der synaptischen Partner unternahm ich erste Schritte in der Array Tomographie, welche hochinformative Analysen von fluoreszierenden Signalen auf einem ultrastrukturellen Level ermöglicht. Dazu testete ich verschieden Wege der Gewebepräparation, um Flureszenzsignale zu erhalten bzw. zu optimieren und bildete erste Überlagerungen der Fluoreszenz- und Elektronenmikrskopbilder. Die Auswertung der elektronenmikroskopischen Bilder erlaubten Mutmaßungen über mö- gliche synaptische Modulationen innerhalb des neuronalen Uhrnetzwerkes durch Gliazellen. Ihre Zellkörper fand ich in unmittelbarer Nähe zu den PDF Neuronen. Im dorsalen Hirn wurden neuronale Modulationen an den kleinen PDF Neuronen durch Gliazellen bereits festgestellt. Auf anatomischer Ebene scheint diese Modulation auch innerhalb der AME zu erfolgen, da synaptische Kontakte, welche PDF-positive Dendriten involvieren, von Gliafasern umgeben sind. Interessanterweise sind diese postsynaptischen PDF Fasern dabei oftmals Teil dyadischer oder sogar multipler Kontakte, die sich gegenüber einer ausgedehnten aktiven Zone befinden. Um mögliche Mechanismen solcher synaptischer Anordnungen zu erklären, versuchte ich den ABC Transporter White im Hirn von Drosophila zu lokalisieren. Seine Präsenz in Gliazellen würde auf einen Recyclingmechanismus hindeuten, welcher eine schnelle Wiederbereitstellung des Transmiters ermöglichen würde. Zusammengefasst scheinen Synapsen mit postsynaptischen PDF-Neuronen in Begleitung von Gliazellen, ein gebräuchliches synaptisches Arrangement innerhalb der AME dazustellen. Diese komplexe Diversität der synaptischen Anordnung reflektiert die komplexen Mechanismen, welche der Verarbeitung der zirkadianen Informationen zugrunde liegen