Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Piscirickettsiosis (también conocida como síndrome rickettsial del salmón), producida por la bacteria Pisciricketsia salmonis, es hoy en día una de las enfermedades que mayores pérdidas causa a la economía, en la industria acuícola del país. Dada su aparición en 1989, en el sur de Chile, la información sobre la infección y sus estrategias de sobrevivencia en el hospedero, son aún todavía escasas. Recientemente, se ha logrado secuenciar el genoma de P. salmonis, pero la anotación y transcriptoma de la bacteria es aún desconocido. Con el fin de conocer un poco más acerca de la estrategia utilizada por P. salmonis para sobrevivir y producir la enfermedad en los peces, en este ensayo se identificó y evaluó, a través de qPCR, la expresión del gen rpoS factor sigma alternativo implicado en la respuesta al estrés en varias Gammaproteobacterias / Fondecyt 1120608

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Hasta la fecha, se han realizado múltiples estudios sobre la transmisión vertical de Piscirickettsia salmonis. Al respecto, se ha demostrado que la bacteria puede infectar ovas durante el proceso de fertilización y que es capaz de adherirse a la superficie coriónica mediante unas estructuras denominadas complejo de adhesión piscirickettsial o CAP. Estos estudios sólo han sido realizados en ovas de la especie trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) utilizando la cepa de referencia LF-89. En la presente memoria, se buscó comparar la infección de dos cepas de esta bacteria (LF-89 y SLGO-95) sobre ovas de salmón del Atlántico (Salmo salar) y trucha arco iris. Los experimentos consistieron en el desafío de ovas de las dos especies salmonídeas, con dos suspensiones bacterianas de P. salmonis (cepas LF-89 y SLGO-95) durante distintos tiempos (1, 3, 5, 10, 30 y 60 min) para obtener una cinética de infección. Las muestras de estas ovas fueron sometidas a una técnica “dot-blot” para la detección de P. salmonis, y los resultados fueron analizados densitométricamente mediante un “software” computacional. Además, mediante una técnica de microscopía electrónica de barrido (MEB) se observó la superficie coriónica de ovas de salmón de Atlántico y trucha arco iris con el fin de detectar si la bacteria se unía mediante el CAP. Mediante la técnica de “dot-blot” se estableció que las ovas de salmón del Atlántico son sensibles a la infección con cualquiera de las dos cepas de P. salmonis usadas (SLGO-95 y LF-89), mientras que las ovas de trucha arco iris sólo presentaron positividad a la infección con la cepa SLGO-95. En el caso de la especie salmón del Atlántico se detectó positividad al “dot-blot” en muestras provenientes de ovas desafiadas durante dos tiempos (10 y 60 min) con la cepa SLGO-95 y tres tiempos (5, 10 y 60 min) con la cepa LF-89. Para ovas de trucha arco iris desafiadas con la cepa SLGO-95 se detectó positividad a la infección en cuatro tiempos de desafío (1, 3, 10 y 60 min) bacteria-ova. Mediante el uso de MEB se observó la presencia de CAP sobre la superficie de ovas de salmón del Atlántico y trucha arco iris desafiadas 5 min a ambas cepas de P. salmonis. Los resultados de “dot-blot” y MEB permiten concluir que ambas cepas se unen e infectan a las ovas de salmón del Atlántico, lo cual es el primer indicio de una posible infección vertical en dicha especie. Por otra parte, el método “dot-blot” no permitió comparar la cinética de infección entre ovas y cepas de bacterias, por lo que sólo se pudo utilizar como una técnica cualitativa para la detección de P. salmonis.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / Piscirickettsia salmonis es una bacteria intracelular facultativa, de tipo cocoide, de 0,5 a 1,5 μm de diámetro, gramnegativa, inmóvil, y se encuentra asociada a cuadros clínicos de tipo septicémico con alta mortalidad en salmones de cultivo en Chile. Las formas de transmisión no son claramente conocidas. En condiciones experimentales se ha demostrado que el microorganismo produce un sistema de adhesión a las ovas, denominado Complejo de Adhesión Piscirickettsial (CAP) y que probablemente corresponda a un factor de virulencia. Por otra parte, existe evidencia de la presencia de P. salmonis en órganos de moluscos bivalvos, como es el chorito (Mytilus chilensis) y otras especies de animales acuáticos. El presente estudio tuvo como objetivo establecer la unión de P. salmonis mediante la formación del CAP a la superficie de conchas de chorito, y su capacidad de infectar un cultivo con células CHSE-214 de peces una vez formado el sistema de adhesión. Como inóculo se utilizó un aislado de campo asociado a un brote de piscirickettsiosis en salmón del Atlántico (Salmo salar). El microorganismo fue cultivado en la línea celular CHSE-214 libre de antibióticos y fungistáticos, a una temperatura de 15 °C, hasta que se produjo un 100% de efecto citopático (ECP). Se utilizó como inóculo un tercer pasaje, que fue obtenido del sobrenadante, filtrado (2 μm) y titulado en microplacas. El título utilizado correspondió a 105,3 TCID50/ml. Para el desafío se ocuparon trozos de conchas de chorito de aproximadamente 0,5 cm2, previamente sometidos a un proceso de limpieza y desinfección. Para el estudio se realizó una cinética de infección, colocando los trozos de concha en la suspensión bacteriana por inmersión en tubos Eppendorf, en tiempos de 1, 24 o 48 h a temperatura de 15 °C. Cada grupo se realizó en duplicado. Una vez transcurridos los tiempos, las muestras fueron fijadas en glutaraldehído al 3% en cacodilato de sodio, sometidas a secado de punto crítico, sombreadas con oro, observadas y fotografiadas en un microscopio electrónico de barrido. Adicionalmente, dos trozos de concha fueron sometidos a 48 h de infección, luego lavadas en tampón PBS (pH= 7,2) estéril y colocadas en una botella de cultivo con la línea CHSE-214, y observadas para detectar el efecto citopático. Los resultados demostraron la unión de la bacteria mediante CAP a la superficie de la concha a partir del primer tiempo estudiado (1 h). Además, las conchas infectadas por 48 h, colocadas en CHSE-214, mostraron un efecto citopático alrededor de su borde a partir de los 3 días postinfección, para luego a los 14 días producir un ECP de 100%. Estos resultados comprueban la adhesión de P. salmonis a la superficie de conchas de chorito y la posibilidad de liberación de bacterias infectantes al medio. Esto podría tener una implicancia epidemiológica, puesto que en condiciones naturales estas superficies podrían constituirse en reservorios del agente. / Piscirickettsia salmonis is a facultative intracellular bacterium, cocoide type, diameter 0.5 to 1.5 μm, gram-negative, non-motile and is associated with clinical symptoms of sepsis with high mortality in farmed salmon in Chile. Mechanisms of transmission are not clearly known. Experimentally, it has been shown that the microorganism produces a system of adhesion to ova, called “Piscirickettsial Attachment Complex” (PAC) and probably corresponds to a virulence factor. Moreover, there is evidence of the presence of P. salmonis in organs of bivalve molluscs such as mussels (Mytilus chilensis) and other species of aquatic animals. This study aimed to establish the binding of P. salmonis by CAP to the surface of mussels shells, and if once formed this structure, the bacteria could be released and infect cultured fish cells. As inoculum a bacteria was used from an isolated from an outbreak of piscirickettsiosis in Atlantic salmon (Salmo salar). The microorganism was cultured on CHSE-214 cell line free of antibiotics and fungistatics at a temperature of 15 °C, until 100% cytopathic effect was obtained. A third passage was used as inoculum, which was obtained from the supernatant filtered (2 μm) and entitled microplate. The title used corresponded to 105,3 TCID 50/ml. 0,5 cm2 mussel shell pieces were used as challenge, previously subjected to a process of cleaning and disinfection. Kinetics of infection were performed, by placing the shell pieces in a bacterial suspension for 1, 24 or 48 h at 15 °C. Each group was performed in duplicate. The samples were fixed in 2% glutaraldehyde in sodium cacodylate, subjected to critical point drying, shaded with gold, observed and photographed in a scanning electron microscope. Additionally, two shells were subjected to 48 h of infection, then washed in PBS buffer (pH = 7.2) and placed in a sterile culture bottle with CHSE-214 cell line, and observed to detect the cytopathic effect. Results demonstrated the binding of bacteria by CAP to the surface of shell from the first time studied (1 h). In addition, 48 h infected shells placed in CHSE-214, showed cytopathic effect around its edge from 3 days post-infection and then at 14 days producing 100% cytopathic effect. These results prove the adhesion of P. salmonis to the surface of mussel shells and the possibility of releasing infecting bacteria on the environment. This could have epidemiological implications, because under natural conditions these surfaces could become reservoirs of the agent. / Financiamiento: Laboratorio Nacional de Referencia para el Diagnóstico de Enfermedades de Especies Hidrobiológicas, Universidad de Chile; Salmones Humboldt Ltda.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La piscirickettsiosis es una enfermedad bacteriana producida por Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) que provoca severas pérdidas económicas a la industria del salmón en el sur de Chile por conceptos de mortalidad, tratamientos antimicrobianos y el uso de vacunas. Debido a que su signología no es patognomónica se debe recurrir a pruebas de laboratorio para determinar la presencia de su agente etiológico con el fin de establecer medidas de control y tratamientos adecuados. A pesar de que la enfermedad fue descrita en 1989, la patogénesis y las vías de transmisión de la bacteria se encuentran insuficientemente descritas, por lo que la presente Memoria de Título tuvo como uno de sus objetivos determinar la presencia y asociación de P. salmonis en distintas muestras de 19 peces de la especie salmón coho (Oncorhynchus kisutch) afectados por piscirickettsiosis. En esta Memoria de Título se determinó la presencia de P. salmonis mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa anidada (PCR anidado) en el 79%, 95% y 87% de las muestras de hígado, riñón y heces respectivamente. El análisis estadístico realizado mediante el coeficiente de Kappa, determinó que hígado-riñón y riñón-heces están considerablemente asociados, mientras que hígado-heces poseen una moderada asociación. Adicionalmente, de cada órgano estudiado se realizó un análisis por separado de tres fragmentos de tejido con el fin de establecer si existía consistencia en el diagnóstico entre ellas. Los resultados (analizados también con el coeficiente de Kappa), indicaron débil asociación entre las muestras analizadas, lo que sugiere un riesgo para la detección del agente según el fragmento que se utiliza. Al aumentar la cantidad de tejido analizado se demostró que aumenta la posibilidad de detección de la bacteria. Por otra parte, este estudio constituye el primer reporte de la presencia de la bacteria en heces de salmón coho en condiciones de cultivo en mar a través de la técnica de PCR anidado. No obstante lo anterior, son necesarios más estudios para establecer la viabilidad de la bacteria en el contenido fecal. / Piscirickettsiosis is a bacterial disease caused by Piscirickettsia salmonis. It causes severe economic losses in the salmon industry in southern Chile by concepts of mortality, antimicrobial treatments and the use of vaccines. The clinical signs are not pathognomonic and because of that laboratory tests are required to determine the presence of its causative agent in order to establish control measures and treatments. Piscirickettsiosis was described in 1989 but up to this day, the pathogenesis and transmission routes of the bacteria are still inadequately described, because of that reason one of the main objectives of this work was to determine the presence and association of P. salmonis in different samples of 19 coho salmon (O. kitsuch) affected by piscirickettsiosis. The presence of P. salmonis was determined by the technique of Nested Polymerase Chain Reaction (nested PCR) in 79%, 95% and 87% of the samples of liver, kidney and feces respectively. The statistical analysis performed using the Cohen's Kappa coefficient, found that liver-kidney and kidney-feces are significantly associated, whereas liver-feces have a moderate association. Additionally, separate analysis was made of three pieces of tissue in order to establish whereas the diagnosis between them was consistent. The results (also analyzed with Cohen's Kappa coefficient) indicated weak association between the samples analyzed, suggesting a detection risk according to the fragment analyzed. It was demonstrated that increasing the amount of analyzed tissue increases the detectability of the bacteria. Moreover, this study is the first report about the presence of P. salmonis in coho salmon feces in sea farming conditions through technical of nested PCR. Further studies are necessary to establish the viability of the bacteria in the fecal content. / Financiamiento: Laboratorio Nacional de Referencia para el Diagnóstico de Enfermedades de Especies Hidrobiológicas, U. de Chile. Salmones Humboldt Ltda.