Planar cell polarity (PCP) is the organization of cellular characteristics within the plane of a tissue. PCP manifests both structurally, as in the directionality of insect bristles or mammalian skin hair, or dynamically, as in vertebrate neurulation, gastrulation, and oriented cell division in the kidney. Two well-conserved pathways are known to regulate PCP in invertebrates and in vertebrates: the Frizzled/PCP pathway and the Fat-Dachsous (Ft-Ds) pathway. The latter consists of the cadherins Ft and Ds, along with the Golgi kinase Four-jointed (Fj) and the transcriptional co-repressor Atrophin (Atro). Ft and Ds can bind each other, suggesting a mechanism for signal transduction. Fj phosphorylates Ft and Ds, modulating their binding affinities for each other. Atro is proposed to link Ft-Ds signaling with downstream events in the nucleus during eye development. The details of Ft-Ds binding, and the consequences of their interactions with other members of the pathway are poorly understood. In this work, I quantitatively analyzed Ft-Ds pathway mutant clones for their effects on ommatidial polarity in the Drosophila eye. My findings suggest that the Ft-Ds pathway regulates PCP independently of asymmetric cellular accumulation of Ft or Ds. I found that Atro has a position-specific role in regulating polarity in the eye, that Fj dampens clonal polarity signals, and that asymmetric accumulation of the atypical myosin Dachs is not essential for production and propagation of a long-range PCP signal. My observations suggest that Ft and Ds interact to modulate a secondary signal that regulates long-range polarity, that signaling by the Ds intracellular domain is dependent on Ft, and that ommatidial fate specification is genetically separable from long-range signaling.

Au cours de ce projet de thèse, j’ai étudié le lien fonctionnel entre la morphogénèse épithéliale et la signalisation Delta-Notch, dans le cadre de la formation du tube neural chez le poisson-zèbre. La signalisation Delta-Notch est primordiale pour le développement embryonnaire et le maintien de l’homéostasie des tissus adultes. De façon inattendue, j’ai observé suite à la perte-de-fonction de Mib une perte de la polarité apico-basale dans le neuro-épithélium de la moelle épinière embryonnaire. L’analyse plus poussée de ce phénotype m’a ensuite permis de montrer que l’activité de l’intégralité de la signalisation Notch est requise pour l’établissement de la polarité apico-basale dans le tube neural de poisson-zèbre. En effet, l’inhibition des ligands de Notch et des activateurs transcriptionnels situés en aval, Rbpja et Rbpjb, résulte en l’interruption de la polarité apico-basale. De plus, l’activation ectopique de Notch entraîne un sauvetage complet de la polarité apico-basale dans les embryons déplétés pour Mib. Finalement, le mutant Mib échoue à activer la transcription de protéines de polarité apicale Crumbs1 et Crumbs2a au cours de la formation du tube neural, ce qui suggèrerait que la signalisation Notch agit en amont des complexes de polarité. De façon surprenante, nous avons également montré que le composant de la signalisation Notch, Mib, affecte les mouvements de convergence-extension et la division cellulaire orientée, appelée C-divisions, durant la neurulation et la gastrulation à travers la signalisation PCP. Cet effet de Mib sur la PCP est indépendant de son rôle sur la signalisation Notch. Généralement, cette étude révèle un double-rôle de Mib. / In this Ph.D. project, I study the functional link between epithelial polarity and Delta-Notch signaling in the context of zebrafish neural tube morphogenesis. Notch signaling, one of the major signaling pathways and of prime importance in neurogenesis, has been widely studied for its function in cell fate specifications. Surprisingly, I found that the Notch signaling component Mindbomb (Mib) loss-of-function led to a loss of apico-basal polarity in the neuroepithelium of the embryonic spinal cord. I further explored that the activity of the entire Notch signaling pathway is actually required for the earliest steps of establishment of apico-basal polarity in the zebrafish neural tube. Indeed, inhibition of Notch ligands and downstream transcriptional activators Rbpja and Rbpjb resulted in a disruption of apico-basal polarity. Moreover, ectopic activation of Notch ensued to a complete rescue of apico-basal polarity in Mib loss of function embryos. Furthermore, Mib mutant embryos fail to upregulate the transcription of the apical polarity proteins Crumbs1 and Crumbs2a in the course of neural tube formation, suggesting that Notch signalling might act upstream of polarity complexes. Moreover, I found that Mib affects convergent-extension movements and oriented cell divisions during neurulation and gastrulation through an effect on planar cell polarity. Remarkably, this effect of Mib on PCP is independent of its role in Notch signaling. These results indicate a novel role of Mib in the regulation of PCP signaling. Altogether, this study revealed a dual role of Mib in the epithelial morphogenesis of the zebrafish neural tube.

La voie de la polarité planaire cellulaire (PCP), aussi connue sous le nom de la voie non-canonique du Frizzled/Dishevelled, contrôle le processus morphogénétique de l'extension convergente (CE) qui est essentiel pour la gastrulation et la formation du tube neural pendant l'embryogenèse. La signalisation du PCP a été récemment associée avec des anomalies du tube neural (ATN) dans des modèles animaux et chez l'humain. Prickle1 est une protéine centrale de la voie PCP, exprimée dans la ligne primitive et le mésoderme pendant l'embryogenèse de la souris. La perte ou le gain de fonction de Prickle1 mène à des mouvements de CE fautifs chez le poisson zèbre et la grenouille. PRICKLE1 interagit directement avec deux autres membres de la voie PCP, Dishevelled et Strabismus/Vang. Dans notre étude, nous avons investigué le rôle de PRICKLE1 dans l'étiologie des ATN dans une cohorte de 810 patients par le re-séquençage de son cadre de lecture et des jonctions exon-intron. Le potentiel pathogénique des mutations ainsi identifiées a été évalué par des méthodes bioinformatiques, suivi par une validation fonctionnelle in vivo dans un système poisson zèbre. Nous avons identifié dans notre cohorte un total de 9 nouvelles mutations dont sept: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys et p.Ser739Phe, p.Val550Met et p.Asp771Asn qui affectent des acides aminés conservés. Ces mutations ont été prédites in silico d’affecter la fonction de la protéine et sont absentes dans une large cohorte de contrôles de même origine ethnique. La co-injection de ces variantes avec le gène prickle1a de type sauvage chez l’embryon de poisson zèbre a démontré qu’une mutation, p.Arg682Cys, modifie dans un sens négatif le phénotype du défaut de la CE produit par pk1 de type sauvage. Notre étude démontre que PK1 peut agir comme facteur prédisposant pour les ATN chez l’humain et élargit encore plus nos connaissances sur le rôle des gènes de la PCP dans la pathogenèse de ces malformations. / The planar cell polarity pathway (PCP) or the non-canonical Frizzled/Dishevelled pathway controls the morphogenetic process of convergent extension (CE) that is essential during embryogenesis for gastrulation and neural tube formation. Recently, PCP signalling was associated with neural tube defects (NTD) in humans and animal models. The core PCP protein, Prickle1, is expressed in the primitive streak and mesoderm during mouse embryogenesis. Both gain and loss of function of Prickle1 cause faulty CE movements in zebrafish and the frog. PRICKLE1 physically interacts with two other core PCP members, Dishevelled and Strabismus/Vang. In the present study we investigated the role of PRICKLE1 in the aetiology of NTDs in a large cohort of 810 patients through resequencing of its open reading frame and exon-intron junctions. The pathogenicity of the identified mutations was assessed through bioinformatics methods followed by a functional validation in a zebrafish system, in vivo. We identified in our cohort a total of nine novel mutations, of which seven affected conserved amino acids: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys, p.Ser739Phe, p.Val550Met and p.Asp771As. These mutations were predicted to affect the function of the protein in silico and were absent in a large cohort of ethnically-matched controls. Co-injection of these variants with the wild type pk1 in zebrafish oocytes revealed that one mutation, p.Arg682Cys, antagonized the CE phenotype induced by the wild-type zebrafish prickle1a in a dominant fashion. Our study demonstrates that PRICKLE1 can represent a predisposing factor for human NTDs and further expands our knowledge on the role that PCP genes in the pathogenesis of these malformations.

Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies. / Neural tube defects (NTDs), including anencephaly and spina bifida, represent a group of very common birth defects in humans. These anomalies are caused by a partial or complete failure of neural tube closure during embryogenesis. NTDs have a multifactorial etiology involving environmental and genetic factors. The non-canonical signaling pathway Frizzled (Fz) / Dishevelled (Dvl) controls the planar cell polarity (PCP) and the morphogenetic process called convergent extension (CE) which is essential for gastrulation and neural tube closure. Importantly, mutations in genes of this pathway were strongly associated with NTDs in mice and humans. Scribble is a PCP gene that causes a severe NTD mouse Circletail. Scribble binds to another PCP protein, Stbm / Vang, and they cooperate together for the stability of the PCP pathway. Our study aims at investigating the role of SCRIBBLE1 in human NTDs by sequence analyses of its open reading frame and exon-intron junctions. The cohort included in this study consisted of 396 patients recruited at the Spina Bifida Centre of Gaslini Hospital in Genoa, Italy, and 83 patients recruited at the Spina Bifida Center of the Sainte Justine Hospital, Montreal, Canada. Patients were affected by several forms of NTDs. We identified nine non-synonymous and rare mutations in 10 patients: p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) and p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Five of those mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, were absent in all controls analyzed and were predicted to be pathogenic using bioinformatics. Our study demonstrates that rare mutations in SCRIB1 could predispose to NTDs in a fraction of patients. The identification of genes that predispose to ATN will help us better understand the pathogenic mechanisms involved in these diseases.

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Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies. / Neural tube defects (NTDs), including anencephaly and spina bifida, represent a group of very common birth defects in humans. These anomalies are caused by a partial or complete failure of neural tube closure during embryogenesis. NTDs have a multifactorial etiology involving environmental and genetic factors. The non-canonical signaling pathway Frizzled (Fz) / Dishevelled (Dvl) controls the planar cell polarity (PCP) and the morphogenetic process called convergent extension (CE) which is essential for gastrulation and neural tube closure. Importantly, mutations in genes of this pathway were strongly associated with NTDs in mice and humans. Scribble is a PCP gene that causes a severe NTD mouse Circletail. Scribble binds to another PCP protein, Stbm / Vang, and they cooperate together for the stability of the PCP pathway. Our study aims at investigating the role of SCRIBBLE1 in human NTDs by sequence analyses of its open reading frame and exon-intron junctions. The cohort included in this study consisted of 396 patients recruited at the Spina Bifida Centre of Gaslini Hospital in Genoa, Italy, and 83 patients recruited at the Spina Bifida Center of the Sainte Justine Hospital, Montreal, Canada. Patients were affected by several forms of NTDs. We identified nine non-synonymous and rare mutations in 10 patients: p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) and p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Five of those mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, were absent in all controls analyzed and were predicted to be pathogenic using bioinformatics. Our study demonstrates that rare mutations in SCRIB1 could predispose to NTDs in a fraction of patients. The identification of genes that predispose to ATN will help us better understand the pathogenic mechanisms involved in these diseases.

La voie de la polarité planaire cellulaire (PCP), aussi connue sous le nom de la voie non-canonique du Frizzled/Dishevelled, contrôle le processus morphogénétique de l'extension convergente (CE) qui est essentiel pour la gastrulation et la formation du tube neural pendant l'embryogenèse. La signalisation du PCP a été récemment associée avec des anomalies du tube neural (ATN) dans des modèles animaux et chez l'humain. Prickle1 est une protéine centrale de la voie PCP, exprimée dans la ligne primitive et le mésoderme pendant l'embryogenèse de la souris. La perte ou le gain de fonction de Prickle1 mène à des mouvements de CE fautifs chez le poisson zèbre et la grenouille. PRICKLE1 interagit directement avec deux autres membres de la voie PCP, Dishevelled et Strabismus/Vang. Dans notre étude, nous avons investigué le rôle de PRICKLE1 dans l'étiologie des ATN dans une cohorte de 810 patients par le re-séquençage de son cadre de lecture et des jonctions exon-intron. Le potentiel pathogénique des mutations ainsi identifiées a été évalué par des méthodes bioinformatiques, suivi par une validation fonctionnelle in vivo dans un système poisson zèbre. Nous avons identifié dans notre cohorte un total de 9 nouvelles mutations dont sept: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys et p.Ser739Phe, p.Val550Met et p.Asp771Asn qui affectent des acides aminés conservés. Ces mutations ont été prédites in silico d’affecter la fonction de la protéine et sont absentes dans une large cohorte de contrôles de même origine ethnique. La co-injection de ces variantes avec le gène prickle1a de type sauvage chez l’embryon de poisson zèbre a démontré qu’une mutation, p.Arg682Cys, modifie dans un sens négatif le phénotype du défaut de la CE produit par pk1 de type sauvage. Notre étude démontre que PK1 peut agir comme facteur prédisposant pour les ATN chez l’humain et élargit encore plus nos connaissances sur le rôle des gènes de la PCP dans la pathogenèse de ces malformations. / The planar cell polarity pathway (PCP) or the non-canonical Frizzled/Dishevelled pathway controls the morphogenetic process of convergent extension (CE) that is essential during embryogenesis for gastrulation and neural tube formation. Recently, PCP signalling was associated with neural tube defects (NTD) in humans and animal models. The core PCP protein, Prickle1, is expressed in the primitive streak and mesoderm during mouse embryogenesis. Both gain and loss of function of Prickle1 cause faulty CE movements in zebrafish and the frog. PRICKLE1 physically interacts with two other core PCP members, Dishevelled and Strabismus/Vang. In the present study we investigated the role of PRICKLE1 in the aetiology of NTDs in a large cohort of 810 patients through resequencing of its open reading frame and exon-intron junctions. The pathogenicity of the identified mutations was assessed through bioinformatics methods followed by a functional validation in a zebrafish system, in vivo. We identified in our cohort a total of nine novel mutations, of which seven affected conserved amino acids: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys, p.Ser739Phe, p.Val550Met and p.Asp771As. These mutations were predicted to affect the function of the protein in silico and were absent in a large cohort of ethnically-matched controls. Co-injection of these variants with the wild type pk1 in zebrafish oocytes revealed that one mutation, p.Arg682Cys, antagonized the CE phenotype induced by the wild-type zebrafish prickle1a in a dominant fashion. Our study demonstrates that PRICKLE1 can represent a predisposing factor for human NTDs and further expands our knowledge on the role that PCP genes in the pathogenesis of these malformations.

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Doctor of Philosophy / Department of Biology / Michael A. Herman / The polarities of several cells that divide asymmetrically during C. elegans development are controlled by Wnt signaling. LIN-44/Wnt and LIN-17/Fz control the polarities of cells in the tail of developing C. elegans larvae, including the male-specific blast cell, B, which divides asymmetrically to generate a larger anterior daughter and a smaller posterior daughter. We determined that the canonical Wnt pathway components are not involved in the control of B cell polarity. However, POP-1/Tcf is involved and asymmetrically distributed to B daughter nuclei. Aspects of the B cell division are reminiscent of the divisions controlled by the planar cell polarity (PCP) pathway that has been described in both Drosophila and vertebrate systems. We identified C. elegans homologs of Wnt/PCP components and have determined that many of them appear to be involved in the regulation of B cell polarity and POP-1 asymmetric distribution to B daughter nuclei. Thus a non-canonical Wnt pathway, which is different from other Wnt pathways in C. elegans, but similar to the PCP pathways, appears to regulate B cell polarity. Molecular mechanisms of this PCP pathway were also investigated. We determined that LIN-17/Fz is asymmetrically distributed to the B cell cortex prior to, during, and after, division. Furthermore, the asymmetric localization of LIN-17::GFP is controlled by LIN-44/Wnt and MIG-5/Dsh. The cysteine rich domain (CRD), seven trans-membrane domain and KTXXXW motif of LIN-17 are required for LIN-17 to rescue lin-17, while only seven trans-membrane domains and KTXXXW motif are required for LIN-17 asymmetric localization. MIG-5::GFP asymmetrically localized to the B cell prior to and after division in a LIN-17/Fz dependent manner. We examined the functions of these MIG-5 domains. The DEP domain is required for MIG-5 membrane association, while the PDZ domain is responsible for different levels of MIG-5 in the B daughters. The DEP and PDZ domain are required to rescue B cell polarity defect of mig-5 males, while the DIX domain is not that important. In summary, a novel PCP-like pathway, in which LIN-17 and MIG-5 are asymmetrically localized, is conserved in C. elegans and involved in the regulation of B cell polarity.