京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21311号 / 農博第2296号 / 新制||農||1064(附属図書館) / 学位論文||H30||N5145(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻 / (主査)教授 髙野 義孝, 教授 田中 千尋, 教授 寺内 良平 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

LOPES NETO, Antônio Viana. Atividade fungistática de uma quitinase recombinante do feijão de corda [Vigna unguiculata (L.) (Walp.)] contra Lasiodiplodia theobromae Pat. (Griff. e Maubl.), agente causal da resinose do cajueiro (Anacardium occidentale L.). 2014. 57 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-08T13:45:57Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_avlopesneto.pdf: 1483564 bytes, checksum: 0e776910b7f818898df5c2fc18bff4ec (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:18:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_avlopesneto.pdf: 1483564 bytes, checksum: 0e776910b7f818898df5c2fc18bff4ec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:18:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_avlopesneto.pdf: 1483564 bytes, checksum: 0e776910b7f818898df5c2fc18bff4ec (MD5) Previous issue date: 2014 / The aim of this work was to evaluate the biological activity of a recombinant chitinase (rVuChi) from cowpea (Vigna unguiculata) against the phytopathogenic fungus Lasiodiplodia theobromae. The recombinant protein was expressed in Pichia pastoris, collected and purified after 72h of induction, using a chitin affinity chromatography. The chitinase was eluted from the affinity chromatography using 0.1 M acetic acid. Enzymatic assay was performed against the synthetic substrate (colloidal chitin) in order to determine the activity of the purified recombinant protein. The chitinase displayed a specific activity of 5,637.32 U/mg of protein. Biological tests were performed. In these tests three different isolates of L. theobromae, identified as CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184, were used and the experiments were performed on triplicate. The fungal isolates were obtained from the collection of work from the laboratory of plant pathology from the Embrapa Agroindústria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). In all biological assays the fungicide Carbomax 500 SC® (Carbendazim) at a concentration of 2 mL/L and sterile distilled water were used as positive and negative controls, respectively. A total of 50, 100 and 300 µg of recombinant chitinase (rVuChi) was used in all tests. The first test was based on the disk diffusion methodology using filter paper in which the effects of the protein on the mycelium growth, as well as the formation of an inhibition zone on the fungal hyphae were investigated. The second test was based on the diffusion assay in agar. Photographs were used to register the observations. The rVuChi showed moderate to strong fungistatic activities on the mycelial growth of all L. theobromae isolates when used at 100 and 300 µg in the disk diffusion assay. CNPAT CCJ-127 was the most resistant specimen to the rVuChi fungistatic action, as observed by the lower impact of the protein on it is mycelial growth. In the agar diffusion test the amount of 300 µg was the most effective, as observed in the disk diffusion test. In addition, the effect of the protein was most pronounced on the isolates CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184 and less impacting on CNPAT CCJ-127. The recombinant chitinase rVuCHi showed to be an inhibitor of the mycelial growth of three L. theobromae isolates. The fungistatic effects of the protein described here may be due to its ability to degrade chitin, a structural biopolymer that makes part of the cell wall of several phytopathogenic fungi, including L. theobromae. Once this is only a scientific speculation, more studies need to be made to definitely reveal the mechanism of action of rVuChi on L. theobromae. / O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade biológica de uma quitinase recombinante (rVuChi) de feijão-caupi (Vigna unguiculata) contra o fungo fitopatogênico Lasiodiplodia theobromae. A proteína recombinante foi expressa em Pichia pastoris, coletada e purificada após 72h de indução, utilizando cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A quitinase foi eluída a partir da cromatografia de afinidade com ácido acético a 0,1 M. Ensaio enzimático foi realizado contra o substrato sintético (quitina coloidal), a fim de determinar a atividade da proteína recombinante purificada. A quitinase apresentou atividade específica de 5.637,32 U/mg de proteína. Testes biológicos foram realizados. Nestes testes três diferentes isolados de L. theobromae, identificados como CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184, foram utilizados e os experimentos foram realizados em triplicata. Os isolados fúngicos foram obtidos da coleção de trabalho do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Agroindústria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). Em todos os ensaios biológicos o fungicida Carbomax 500 SC® (Carbendazim), a uma concentração de 2 mL/L, e água destilada estéril foram utilizados como controles positivos e negativos, respectivamente. Um total de 50, 100 e 300 µg de quitinase recombinante (rVuChi) foi utilizado em todos os testes. O primeiro ensaio foi baseado na metodologia de difusão em disco de papel de filtro em que foram investigados os efeitos da proteína sobre o crescimento do micélio, bem como a formação de halo de inibição sobre o crescimento micelial do fungo. O segundo ensaio foi baseado no ensaio de difusão em ágar. Fotografias foram usadas para registrar as observações. A quitinase rVuChi mostrou efeito fungistático variando de moderado a forte sobre o crescimento micelial de todos os isolados de L. theobromae, particularmente quando usada nas doses de 100 e 300 µg, no ensaio de difusão em disco. CNPAT CCJ-127 foi o isolado mais resistente à ação fungistática de rVuChi, como observado pelo menor impacto da proteína em seu crescimento micelial. No teste de difusão em ágar a quantidade de 300 µg foi a mais efetiva, da mesma forma como observado para o de difusão em disco de papel de filtro. Além disso, o efeito da proteína foi mais pronunciado nos isolados CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184 e menos impactante no isolado CNPAT CCJ-127. A quitinase recombinante rVuCHi mostrou ser um inibidor do crescimento micelial de três diferentes isolados de L. theobromae. Os efeitos fungistáticos da proteína aqui descritos podem ser devido à sua capacidade de degradar quitina, um biopolímero estrutural que faz parte da parede celular de vários fungos fitopatogênicos, incluindo L. theobromae. Entretanto, mais estudos precisam ser conduzidos para revelar os possíveis mecanismos de ação de rVuChi sobre L. theobromae.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade biolÃgica de uma quitinase recombinante (rVuChi) de feijÃo-caupi (Vigna unguiculata) contra o fungo fitopatogÃnico Lasiodiplodia theobromae. A proteÃna recombinante foi expressa em Pichia pastoris, coletada e purificada apÃs 72h de induÃÃo, utilizando cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A quitinase foi eluÃda a partir da cromatografia de afinidade com Ãcido acÃtico a 0,1 M. Ensaio enzimÃtico foi realizado contra o substrato sintÃtico (quitina coloidal), a fim de determinar a atividade da proteÃna recombinante purificada. A quitinase apresentou atividade especÃfica de 5.637,32 U/mg de proteÃna. Testes biolÃgicos foram realizados. Nestes testes trÃs diferentes isolados de L. theobromae, identificados como CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184, foram utilizados e os experimentos foram realizados em triplicata. Os isolados fÃngicos foram obtidos da coleÃÃo de trabalho do LaboratÃrio de Fitopatologia da Embrapa AgroindÃstria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). Em todos os ensaios biolÃgicos o fungicida Carbomax 500 SC (Carbendazim), a uma concentraÃÃo de 2 mL/L, e Ãgua destilada estÃril foram utilizados como controles positivos e negativos, respectivamente. Um total de 50, 100 e 300 Âg de quitinase recombinante (rVuChi) foi utilizado em todos os testes. O primeiro ensaio foi baseado na metodologia de difusÃo em disco de papel de filtro em que foram investigados os efeitos da proteÃna sobre o crescimento do micÃlio, bem como a formaÃÃo de halo de inibiÃÃo sobre o crescimento micelial do fungo. O segundo ensaio foi baseado no ensaio de difusÃo em Ãgar. Fotografias foram usadas para registrar as observaÃÃes. A quitinase rVuChi mostrou efeito fungistÃtico variando de moderado a forte sobre o crescimento micelial de todos os isolados de L. theobromae, particularmente quando usada nas doses de 100 e 300 Âg, no ensaio de difusÃo em disco. CNPAT CCJ-127 foi o isolado mais resistente à aÃÃo fungistÃtica de rVuChi, como observado pelo menor impacto da proteÃna em seu crescimento micelial. No teste de difusÃo em Ãgar a quantidade de 300 Âg foi a mais efetiva, da mesma forma como observado para o de difusÃo em disco de papel de filtro. AlÃm disso, o efeito da proteÃna foi mais pronunciado nos isolados CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184 e menos impactante no isolado CNPAT CCJ-127. A quitinase recombinante rVuCHi mostrou ser um inibidor do crescimento micelial de trÃs diferentes isolados de L. theobromae. Os efeitos fungistÃticos da proteÃna aqui descritos podem ser devido à sua capacidade de degradar quitina, um biopolÃmero estrutural que faz parte da parede celular de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo L. theobromae. Entretanto, mais estudos precisam ser conduzidos para revelar os possÃveis mecanismos de aÃÃo de rVuChi sobre L. theobromae. / The aim of this work was to evaluate the biological activity of a recombinant chitinase (rVuChi) from cowpea (Vigna unguiculata) against the phytopathogenic fungus Lasiodiplodia theobromae. The recombinant protein was expressed in Pichia pastoris, collected and purified after 72h of induction, using a chitin affinity chromatography. The chitinase was eluted from the affinity chromatography using 0.1 M acetic acid. Enzymatic assay was performed against the synthetic substrate (colloidal chitin) in order to determine the activity of the purified recombinant protein. The chitinase displayed a specific activity of 5,637.32 U/mg of protein. Biological tests were performed. In these tests three different isolates of L. theobromae, identified as CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184, were used and the experiments were performed on triplicate. The fungal isolates were obtained from the collection of work from the laboratory of plant pathology from the Embrapa AgroindÃstria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). In all biological assays the fungicide Carbomax 500 SC (Carbendazim) at a concentration of 2 mL/L and sterile distilled water were used as positive and negative controls, respectively. A total of 50, 100 and 300 Âg of recombinant chitinase (rVuChi) was used in all tests. The first test was based on the disk diffusion methodology using filter paper in which the effects of the protein on the mycelium growth, as well as the formation of an inhibition zone on the fungal hyphae were investigated. The second test was based on the diffusion assay in agar. Photographs were used to register the observations. The rVuChi showed moderate to strong fungistatic activities on the mycelial growth of all L. theobromae isolates when used at 100 and 300 Âg in the disk diffusion assay. CNPAT CCJ-127 was the most resistant specimen to the rVuChi fungistatic action, as observed by the lower impact of the protein on it is mycelial growth. In the agar diffusion test the amount of 300 Âg was the most effective, as observed in the disk diffusion test. In addition, the effect of the protein was most pronounced on the isolates CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184 and less impacting on CNPAT CCJ-127. The recombinant chitinase rVuCHi showed to be an inhibitor of the mycelial growth of three L. theobromae isolates. The fungistatic effects of the protein described here may be due to its ability to degrade chitin, a structural biopolymer that makes part of the cell wall of several phytopathogenic fungi, including L. theobromae. Once this is only a scientific speculation, more studies need to be made to definitely reveal the mechanism of action of rVuChi on L. theobromae.