Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-06-05T18:35:12Z No. of bitstreams: 1 2017_PedroMarettiBrant.pdf: 2836357 bytes, checksum: 9d3963f4506e49546ec09c79daaa34f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-06-20T21:20:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_PedroMarettiBrant.pdf: 2836357 bytes, checksum: 9d3963f4506e49546ec09c79daaa34f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-20T21:20:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_PedroMarettiBrant.pdf: 2836357 bytes, checksum: 9d3963f4506e49546ec09c79daaa34f4 (MD5) Previous issue date: 2017-06-20 / A floricultura no Brasil teve início como atividade secundária da fruticultura nos estados de São Paulo e Santa Catarina no início do século XX e atualmente apresenta um crescimento anual de exportação maior que a média mundial. O Distrito Federal (DF) é o décimo em valor de mercado no país, sendo um mercado altamente promissor por apresentar a maior renda per capita do país. Com a expansão do setor, aumento na incidência das doenças e a constante introdução de mudas e sementes exóticas no país, fatores de cultivo, manejo e sanidade vegetal podem constituir um entrave à produção de ornamentais no país e DF. Ainda assim, pesquisas direcionadas a detecção precisa de espécies virais ocorrendo em plantas ornamentais são incipientes no país e escassas no DF. O estudo de viroma em combinação com as estratégias de Next Generation Sequencing (NGS), tendo o apoio das metodologias de bioinformática, têm possibilitado uma eficiente descrição de diferentes organismos presentes em diferentes amostras biológicas nos mais diversificados ambientes e proporcionado avanços significativos em diferentes campos das ciências, incluindo a virologia vegetal. Neste trabalho, um pool composto por dez espécies de plantas ornamentais provenientes do Viveiro I da NOVACAP (Companhia Urbanizadora da Nova Capital do Brasil) foi submetido ao sequenciamento NGS. Após análise dos dados gerados, por meio de diferentes técnicas de bioinformática, sequências novas foram encontradas, indicando seis prováveis novas espécies virais em diferentes gêneros e famílias. Duas prováveis espécies novas de Nucleorhabdovirus (família Rhabdoviridae) foram identificadas, sendo uma delas em Pachystachys lutea (camarão-amarelo) e a outra em Coreopsis lanceolata (margaridinha). Nesta mesma ornamental, margaridinha, identificou-se também uma provável espécie nova do gênero Umbravirus (família Tombusviridae). Outro representante da família Tombusviridae, neste caso uma espécie classificada no gênero Pelarspovirus, foi identificada em Jasminum nitidum (jasmim estrela). As demais espécies, uma do gênero Cytorhabdovirus e outra uma do gênero Potyvirus, foram detectadas no pool de amostras. Dentre essas prováveis espécies novas de vírus, duas sequências detectadas nas plantas ornamentais C. lanceolata e P. lutea apresentaram maior proximidade com os vírus Sonchus yellow net nucleorhabdovirus (SYNV) e Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus (PYDV), respectivamente, e foram denominadas como Coreopsis mottle-associated virus (CMaV) e Pachystachys mosaic-associated virus (PMaV). Para CMaV e PMaV, o genoma total foi recuperado mediante amplificação genômica nas amostras originais utilizando primers internos sobrepostos, sendo as extremidades 3’ e 5’ recuperadas através da técnica RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends - RACE). Após estes procedimentos, sequências foram obtidas via sequenciamento Sanger, confirmando a alta identidade com a sequência montada in silico pelo NGS. Com a sequência completa dos dois vírus procedeu-se análises filogenéticas. A partir de análises comparativas via alinhamento múltiplo de sequências (MSA), alinhamento pairwise e filogenéticas, propôs-se que CMaV e PMaV sejam prováveis espécies novas para o gênero Nucleorhabdovirus, tendo em vista a identidade nucleotídica de 56,99% entre os genomas de CMaV e SYNV e 46,99% entre PMaV e PYDV. / In Brazil, the floriculture agribusiness started as a minor activity in the São Paulo and Santa Catarina states in the early 20th century and currently its annual market growth is bigger than worldwide’s mean. The Federal District (DF) is ranked in the 10th place in terms of market value in Brazil, being a highly promising market due to the high average per capita income of its population. With the expansion of this sector, it was observed a significant increase in the incidence of diseases due to the constant transit and introduction into the country of exotic plant material and seeds. In addition, the implementation of new crop management practices is also having direct effects on disease outbreaks. These factors may affect the sustainability of the ornamental plant agribusiness sector in the country. Research efforts aiming to develop accurate diagnostic tools for viral species occurring in ornamental plants are yet incipient in the country. The virome study employing Next Generation Sequencing (NGS) techniques, combined with bioinformatics methods, has been considered as the most powerful strategy aiming to exploit the genetic diversity of organisms present in any biological sample and allowed significant advances in different fields of science, including plant virology. For this work a pool of ten ornamental plants from NOVACAP (Companhia Urbanizadora da Nova Capital do Brasil) Nursery 1 was sent to NGS. Posterior to data analysis, the sequences obtained were compared to reference genomes from DNA data banks and assembled, producing potential six plant virus sequences in different genera and families. Two probable new species from Nucleorhabdovirus (Rhabdoviridae family) were identified, one in Pachystachys lutea and other in Coreopsis lanceolata. In this ornamental plant, C. lanceolata, it was identified as well a probable new species of the genus Umbravirus (Tombusviridae family). Other member of the Tombusviridae family, now from the Pelarspovirus genus, was identified in Jasminum nitidum. Two of the assembled species, one of the Cytorhabdovirus genus and other from the Potyvirus genus, were detected in the pool only. Among these probable new viral species, two sequences that were detected in the ornamental plants C. lanceolata and P. lutea were close to the Sonchus yellow net nucleorhabdovirus (SYNV) and Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus (PYDV) viruses, respectively, and were named as Coreopsis mottle-associated virus (CMaV) and 4 Pachystachys mosaic-associated virus (PMaV). For CMaV and PMaV, the total genome was recovered by amplifying the genome from the original samples using sintesyzed primers, while the 3’ and 5’ ends with the RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) technique. Posterior to these assays, sequences were obtained from Sanger sequencing method, confirming the high identity with the in silico assembled sequence from NGS. With the complete sequence of both viruses, phylogenetics assays were made. With the multiple sequence alignment (MSA), pairwise alignment and phylogenetics, we propose that CMaV and PMaV are probable new viruses from the Nucleorhabdovirus genus, as the nucleotide identity of the genome were 56.99% from CMaV and SYNV and 46.99% from PMaV and PYDV.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, Brasília, 2014. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2014-08-12T13:27:23Z No. of bitstreams: 1 2014_RafaelaCristinaFerreiraBorges_Parcial.pdf: 2768328 bytes, checksum: 7e1025646edc62fe1a390d6722f2f79a (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-08-12T16:34:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_RafaelaCristinaFerreiraBorges_Parcial.pdf: 2768328 bytes, checksum: 7e1025646edc62fe1a390d6722f2f79a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-12T16:34:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_RafaelaCristinaFerreiraBorges_Parcial.pdf: 2768328 bytes, checksum: 7e1025646edc62fe1a390d6722f2f79a (MD5) / A teca (Tectona grandis) é uma espécie florestal nativa do subcontinente Índico e do Sudeste Asiático que foi introduzida no Centro-Oeste Brasileiro a partir da década de 1970. Essa espécie possui alto valor comercial por apresentar madeira de alta durabilidade e resistência. A madeira pode ser usada para a confecção de móveis finos, esquadrias, pisos, construção naval e painéis. As duas principais doenças que afetam a cultura da teca são de etiologia fúngica: a ferrugem causada por (Olivea tectonae) e o cancro da teca. Nos últimos anos, o cancro da teca vem ganhando importância pelo grande número de árvores afetadas. Assim, considerando a importância desta doença, é necessária a busca de alternativas de controle, a partir de conhecimentos básicos sobre a enfermidade como: etiologia, variabilidade genética da população do patógeno e caracterização morfocultural, molecular e patogênica de isolados do fungo L. theobromae, identificado como o agente causal. Assim, discos de madeira com sintomas de escurecimento em povoamento de Teca foram coletados no estado do Mato Grosso, dos quais foram obtidos isolados de L. theobromae. As colônias fúngicas foram caracterizadas morfologicamente e a identificação de L. theobromae foi confirmada. Os isolados estudados foram caracterizados morfologicamente em culturais, avaliados quanto ao crescimento micelial em BDA, MEA, V8, Aveia-ágar e Cenoura-ágar, nas temperaturas de 25, 30 e 35°C. Para a caracterização molecular, realizou-se a extração do DNA de todos os isolados estudados através do método CTAB modificado. O DNA total foi submetido à reação de PCR para amplificação das regiões intergênicas do DNA ribossomal (regiões ITS1 e ITS2) e fator de elongação, a partir dos primers ITS1, ITS4 e TEF1-F, EF1-728F. A fim de comprovar a patogenicidade, mudas de teca foram inoculadas com dois isolados de L. theobromae (RB01) e (RB05) em três clones designados A, B e C. As inoculações foram unidirecionais quando se usou isolados de outras hospedeiras no clone A de teca. Os isolados de L. theobromae cresceram melhor em BDA, MEA e V8 a partir de 25°C com temperatura ótima da 35°C. As análises de sequencia das regiões do fator de elongação da tradução e do DNA ribosomal confirmaram a classificação dos isolados de teca como Lasiodiplodia theobromae. De acordo com o teste de patogenicidade, verificou-se que os clones A, B e C mostraram-se susceptíveis aos dois isolados de L. theobromae estudados. O clone A, proveniente de plantas seminais foi o que apresentou maior susceptibilidade ao isolado de L. theobromae, seguido do clone B, enquanto o clone C apresentou maior resistência. Quando realizada a inoculação unidirecional no clone A, verificou-se que esse clone foi susceptível a todos os isolados estudados, independentemente de origem, diferindo apenas em nível de severidade. Os isolados originários de hospedeiras distintas de teca proporcionaram maiores níveis de doença. A diversidade genética dos isolados foi estudada usando-se marcadores moleculares RAPD (“Random amplified polymorphic DNA”), resultando em quatro grupos e quatorze subgrupos com alta variabilidade dentro dos subgrupos. A similaridade dos isolados variou de 50% a 100%, sendo que estes com 100% de similaridade são isolados obtidos de teca. / Teak (Tectona grandis) is a forest species native to the Indian subcontinent and Southeast Asia, and it was introduced in Brazil’s midwestern region in the 1970s. This species has a high commercial value, because its timber is highly durable and resistant. The wood may be used to make fine furniture, door and window frames, floors, naval constructions and panels. The two main diseases that affect teak plantations are of fungal etiology; they are rust caused by Olivea tectonae and teak canker. In recent years, teak canker has been increasingly important in that it affects a large number of trees. Thus, considering the importance of this disease, alternatives for its control need to be sought, using basic knowledge about the disease such as its etiology, the genetic variability of the pathogen population, and the morphocultural, molecular and pathogenic characterization of isolates of the fungus L. theobromae, identified as the causal agent. To this end, discs of wood with darkening symptoms were collected in a teak plantation in the state of Mato Grosso and, from these, isolates of L. theobromae were obtained. The fungal colonies were morphologically characterized, and the identification of L. theobromae was confirmed. The isolates studied were morphologically characterized in culture media and evaluated for mycelial growth in PDA, MEA, V8, oatmeal-agar and carrot-agar, at temperatures of 25, 30 and 35°C. For molecular characterization, extraction of DNA was carried out for all isolates studied, using the modified CTAB method. Total DNA was submitted to PCR for amplification of the intergene regions of ribosomal DNA (regions ITS1 and ITS2) and elongation factor, from the primers ITS1, ITS4 and TEF1-F, EF1-728F. To prove the pathogenicity, teak seedlings were inoculated with two isolates of L. theobromae (RB01) and (RB05) in three clones designated A, B and C. The inoculations were unidirectional when isolates were used from other hosts in clone A of teak. The isolates of L. theobromae grew better on PDA, MEA and V8 from 25°C upwards, with an optimum temperature of 35°C. The isolates studied were not clearly distinguished when only sequences of ITS and TEF were used. In accordance with the pathogenicity test, it was confirmed that clones A, B and C were susceptible to the two isolates of L. theobromae studied. Clone A from the seminal plants was the one that presented the greatest susceptibility to the isolate of L. theobromae, followed by clone B, while clone C presented greatest resistance. When unidirectional inoculation of clone A was done, it was confirmed that this clone was susceptible to all the isolates studied, independent of their origin, differing only in level of severity. The original isolates from non-teak hosts provided the highest disease levels. The genetic diversity of the isolates was studied using RAPD molecular markers (Random amplified polymorphic DNA), resulting in four groups and 14 subgroups with high variability within the subgroups. The similarity of the isolates varied from 50% to 100%, and those with 100% similarity were isolates obtained from teak.