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Desenvolvimento de uma estratégia automática para busca de potenciais antígenos em proteomas preditos de Plasmodiumspp

Ribeiro, Ricardo de Souza January 2013 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-06T18:32:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_RicardodeSouzaRibeiro.pdf: 1191496 bytes, checksum: cdb1da9294c409d1a1f2a403b87cf9c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T18:32:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_RicardodeSouzaRibeiro.pdf: 1191496 bytes, checksum: cdb1da9294c409d1a1f2a403b87cf9c9 (MD5) Previous issue date: 2013 / A malária é uma doença que provoca um enorme impacto em todo mundo e muitos esforços tem sido feitos na tentativa de eliminar esta doença há séculos. O desenvolvimento de uma vacina eficaz contra esta doença se tornou prioridade para muitos grupos de pesquisa, entretanto apenas um antígeno apresentou resultados promissores em ensaios clínicos de fase III. O processo de identificação de candidatos promissores para comporem uma vacina é muito laborioso e demanda um tempo muito grande, principalmente devido à biologia complexa destes parasitos intracelulares. Identificar proteínas nesses tipos de patógenos intracelulares é um grande desafio e requer a análise de diferentes fatores ao mesmo tempo. Um bom candidato a antígeno deve possuir características que façam com que a proteína ou pelo menos parte dela, entre em contato com o sistema imune do hospedeiro em algum momento do ciclo de vida do parasito e que este contato seja capaz de gerar uma resposta imune capaz de neutralizar o parasito e acabar com a infecção. As proteínas secretadas/exportadas se encaixam perfeitamente nessas características e foi justamente com o objetivo de identificá-las que foi desenvolvida uma estratégia automática integrando diferentes programas para buscar estas proteínas. Dessa forma, o proteoma predito de 5 espécies diferentes do gênero Plasmodium foi submetidas à análise de três programas que procuram por características importantes para proteínas exportadas/secretadas nesse gênero. O peptídeo sinal foi investigado utilizando o SignalP, um script em Perl foi desenvolvido para buscar um motivo que é crucial para a exportação de algumas proteínas (PEXEL) e os domínios transmembrana foram buscados utilizando o TMHMM. Algumas proteínas selecionadas foram submetidas à predição de epitopos de células B. Com esta abordagem foi possível identificar algumas famílias de proteínas que já são conhecidas como proteínas exportadas, como Rifin e Stevor, o que mostra que esta abordagem pode ser uma ferramenta útil na identificação de novos prováveis alvos para o desenvolvimento de uma vacina eficaz. Utilizando esta metodologia, esperamos contribuir para aumentar o número de proteínas em testes para formulação de um antígeno que seja capaz de ajudar no controle e erradicação desta doença que causa tantos prejuízos para a humanidade. / Malaria is a disease that causes a huge impact around the world and many efforts have been made in an attempt to eliminate this disease for centuries. The development of an effective vaccine against this disease has become a priority for many research groups, however only one antigen showed promising results in phase III clinical trials. The process of identifying promising candidates to compose a vaccine is very laborious and requires a very long time, mainly due to the complex biology of these intracellular parasites. Identify proteins in these types ofintracellular pathogens is a major challenge and requires the analysis of different factors simultaneously. A good candidate antigen must possess characteristics that make the protein or at least part of it, contact the host immune system at some point in the life cycle of the parasite and that this contact is able to generate an immune response capable to neutralize the parasite and stop the infection. The proteins secreted / exported fit perfectly and it was precisely these characteristics in order to identify them we developed a strategy that automatically integrating different programs to find these proteins. Thus, the predicted proteome of 5 different species of the genus Plasmodium was subjected to analysis of three programs looking for important features for proteins exported/secreted in this genre. The signal peptide was investigated using SignalP, a Perl script was developed to find a subject that is crucial for the export of some proteins (PEXEL) and transmembrane domains using TMHMM were searched. Some selected proteins were subjected to prediction of B cell epitopes With this approach it was possible to identify some protein families that are already known as proteinsexported as Rifin and Stevor, showing that this approach can be a useful tool in identifying new likely targets for the development of an effective vaccine. Using this methodology, we hope to contribute to increasing the number of proteins in tests for formulation of an antigen that is able to help control and eradicate the disease that causes so much harm to humanity.
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Diagnóstico molecular de infecção malárica em aldeias indígenas ianomâmis

Robortella, Daniela Rocha. January 2016 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T11:22:10Z No. of bitstreams: 1 Robortella_Diagnóstico molecular de infecção maláricas_2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T11:22:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Robortella_Diagnóstico molecular de infecção maláricas_2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T11:22:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robortella_Diagnóstico molecular de infecção maláricas_2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:24:59Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Robortella_Diagnostico molecular de infeccao malaricas_2016.pdf.txt: 147676 bytes, checksum: e74efc2c2c5793a2927f4ba6c4952b6f (MD5) Robortella_Diagnostico molecular de infeccao malaricas_2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Nos últimos anos, a incidência de malária no Brasil vem reduzido significativamente, particularmente, em virtude das medidas de controle. Neste novo cenário, faz-se necessário identificar e tratar a malária submicroscópica, uma vez que estes indivíduos constituem fonte de infecção para o mosquito vetor. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa vem aprimorando o diagnóstico molecular de malária e, recentemente, padronizou uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), altamente sensível, para a detecção de alvos não ribossomais (Pvr47 e Pfr364) dos plasmódios. Baseado nestes achados, o objetivo do presente trabalho foi investigar a malária subpatente em tribos indígenas de povos Ianomâmis, onde as baixas parasitemias parecem ser frequentes. A população de estudo foi constituída de indivíduos pertencentes a cinco aldeias ianomâmis do Polo Base Marari, estado do Amazonas. O estudo envolveu dois cortes transversais, sendo realizados nos meses de setembro (primeiro corte transversal) e novembro (segundo corte trans versal) de 2014. Foram incluídos no estudo um total de 914 indígenas, com cerca de 1590 amostras de sangue coletadas em papel de filtro. Para o diagnóstico molecular de malária, quatro diferentes protocolos de PCR foram utilizados, sendo três baseados em alvos ribossomais (18S rRNA) e um em alvos não ribossomais (Pvr47/Pfr364) dos plasmódios. Os resultados aqui obtidos permitiram demonstrar que os alvos Pvr47/Pfr364 foram os mais sensíveis para o diagnóstico de malária submicroscópica, embora não se mostraram adequados para o diagnóstico de espécie. Dentre os protocolos baseados no gene 18S rRNA aqui utilizados (Nested-PCR, RT-Mangold e RT-Rougemont), a Nested-PCR (método molecular de referência) se mostrou mais apropriada para o diagnóstico específico das infecções maláricas submicroscópicas. Em conjunto, este estudo de infecção malárica em populações ianomâmis permitiu demonstrar que: (i) enquanto 0,9% das amostras foram positivas pela microscopia ótica (MO), diagnóstico de rotina, os protocolos moleculares identificaram 7,8% de postividade; (ii) P. vivax foi a espécie predominante, seguido do P. malariae e P. falciparum em proporções similares; (iii) a positividade por malária diminuiu com a idade (crianças>adolescentes>adultos) e foi influenciada pelas variações sazonais (setembro>novembro); (iv) a prevalência de malária variou significativamente nas diferentes aldeias, sugerindo que a doença não está homogeneamente distribuída na área de estudo. Espera-se que os resultados aqui obtidos possam contribuir para o direcionamento e monitoração de medidas de controle em reservas indígenas, bem como estimar a real incidência de malária nas áreas sob vigilância epidemiológica. / In the last few years, considerable success in reducing malaria incidence has been achieved in Brazil mainly as result of global efforts to control disease. In this new scenario, the need to detect and treat submicoscopic infections is becoming increasing important, as these individuals can be a source of infection for mosquito vectors. Aiming to improve molecular diagnosis of malaria, our research group has standardized a real-time PCR protocol (RT-PCR), highly sensible, for the detention of non-ribossomal plasmodium targets. Based on these findings, the goal of the present work was to investigate subpatent malaria infection in ianomâmis indigenous tribes, where low levels of parasitaemia seems to be common. The study population involved five Ianomâmis communities from the indigenous district of “Polo Base Marari”, Amazon state. Two cross-sectional studies were carried-out by the research team, in september (first survey) and november (second survey) of 2014. A total of 914 indigenous were involved in the study, and 1590 blood samples were collected in filter paper. For molecular diagnosis of malaria, four different PCR protocols were tested, three based on ribossomal (18S rRNA) target and one non-ribosomal (Pvr47/Pfr364). The result s obtained demonstrated that Pvr47/Pfr364 was the most sensitive protocol, however, these targets did not differentiate Plasmodium species. Among the protocols based on the 18S rRNA gene (Nested-PCR, RT-Mangold and RT-Rougemont), the Nested-PCR (reference molecular method) was more suitable for the specific diagnosis of submicroscopic infection. Taken together, this study of malaria infection in Yanomani population showed that: (i) while 0.9% of positivity was detected by the optical microscopy (MO), the conventional routine diagnosis, molecular diagnosis was able to detect 7,8%; (ii) P. vivax was the most prevalent specie in the area, followed by P. malariae and P. falciparum in similar proportions; (iii) malaria positivity decreased with age (children>teenagers>adults) and fluctuates according to seasonal variations (september>november); (iv) malaria prevalence varied accor ding to the Yanomani tribe, which suggest that malaria is not homogeneous transmitted in the study area. The results presented here may account for strategic plans to control malaria in indigenous populations, and to estimate the real malaria incidence in areas under epidemiological vigilance.
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Diagnóstico molecular de infecção malárica em aldeias indígenas ianomâmis

Robortella, Daniela Rocha January 2016 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-24T18:25:15Z No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Robortella_Diagnóstico_CPqRR-2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-24T18:25:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Robortella_Diagnóstico_CPqRR-2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T18:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Robortella_Diagnóstico_CPqRR-2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 3 D_Mestrado_Robortella_Diagnostico_CPqRR-2016.pdf.txt: 147676 bytes, checksum: e74efc2c2c5793a2927f4ba6c4952b6f (MD5) D_Mestrado_Robortella_Diagnostico_CPqRR-2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Nos últimos anos, a incidência de malária no Brasil vem reduzido significativamente, particularmente, em virtude das medidas de controle. Neste novo cenário, faz-se necessário identificar e tratar a malária submicroscópica, uma vez que estes indivíduos constituem fonte de infecção para o mosquito vetor. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa vem aprimorando o diagnóstico molecular de malária e, recentemente, padronizou uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), altamente sensível, para a detecção de alvos não ribossomais (Pvr47 e Pfr364) dos plasmódios. Baseado nestes achados, o objetivo do presente trabalho foi investigar a malária subpatente em tribos indígenas de povos Ianomâmis, onde as baixas parasitemias parecem ser frequentes. A população de estudo foi constituída de indivíduos pertencentes a cinco aldeias ianomâmis do Polo Base Marari, estado do Amazonas. O estudo envolveu dois cortes transversais, sendo realizados nos meses de setembro (primeiro corte transversal) e novembro (segundo corte transversal) de 2014. Foram incluídos no estudo um total de 914 indígenas, com cerca de 1590 amostras de sangue coletadas em papel de filtro. Para o diagnóstico molecular de malária, quatro diferentes protocolos de PCR foram utilizados, sendo três baseados em alvos ribossomais (18S rRNA) e um em alvos não ribossomais (Pvr47/Pfr364) dos plasmódios. Os resultados aqui obtidos permitiram demonstrar que os alvos Pvr47/Pfr364 foram os mais sensíveis para o diagnóstico de malária submicroscópica, embora não se mostraram adequados para o diagnóstico de espécie. Dentre os protocolos baseados no gene 18S rRNA aqui utilizados (Nested-PCR, RT-Mangold e RT-Rougemont), a Nested-PCR (método molecular de referência) se mostrou mais apropriada para o diagnóstico específico das infecções maláricas submicroscópicas. Em conjunto, este estudo de infecção malárica em populações ianomâmis permitiu demonstrar que: (i) enquanto 0,9% das amostras foram positivas pela microscopia ótica (MO), diagnóstico de rotina, os protocolos moleculares identificaram 7,8% de postividade; (ii) P. vivax foi a espécie predominante, seguido do P. malariae e P. falciparum em proporções similares; (iii) a positividade por malária diminuiu com a idade (crianças>adolescentes>adultos) e foi influenciada pelas variações sazonais (setembro>novembro); (iv) a prevalência de malária variou significativamente nas diferentes aldeias, sugerindo que a doença não está homogeneamente distribuída na área de estudo. Espera-se que os resultados aqui obtidos possam contribuir para o direcionamento e monitoração de medidas de controle em reservas indígenas, bem como estimar a real incidência de malária nas áreas sob vigilância epidemiológica. / In the last few years, considerable success in reducing malaria incidence has been achieved in Brazil mainly as result of global efforts to control disease. In this new scenario, the need to detect and treat submicoscopic infections is becoming increasing important, as these individuals can be a source of infection for mosquito vectors. Aiming to improve molecular diagnosis of malaria, our research group has standardized a real-time PCR protocol (RTPCR), highly sensible, for the detention of non-ribossomal plasmodium targets. Based on these findings, the goal of the present work was to investigate subpatent malaria infection in ianomâmis indigenous tribes, where low levels of parasitaemia seems to be common. The study population involved five Ianomâmis communities from the indigenous district of “Polo Base Marari”, Amazon state. Two cross-sectional studies were carried-out by the research team, in september (first survey) and november (second survey) of 2014. A total of 914 indigenous were involved in the study, and 1590 blood samples were collected in filter paper. For molecular diagnosis of malaria, four different PCR protocols were tested, three based on ribossomal (18S rRNA) target and one non-ribosomal (Pvr47/Pfr364). The results obtained demonstrated that Pvr47/Pfr364 was the most sensitive protocol, however, these targets did not differentiate Plasmodium species. Among the protocols based on the 18S rRNA gene (Nested-PCR, RT-Mangold and RT-Rougemont), the Nested-PCR (reference molecular method) was more suitable for the specific diagnosis of submicroscopic infection. Taken together, this study of malaria infection in Yanomani population showed that: (i) while 0.9% of positivity was detected by the optical microscopy (MO), the conventional routine diagnosis, molecular diagnosis was able to detect 7,8%; (ii) P. vivax was the most prevalent specie in the area, followed by P. malariae and P. falciparum in similar proportions; (iii) malaria positivity decreased with age children>teenagers>adults) and fluctuates according to seasonal variations (september>november); (iv) malaria prevalence varied according to the Yanomani tribe, which suggest that malaria is not homogeneous transmitted in the study area. The results presented here may account for strategic plans to control malaria in indigenous populations, and to estimate the real malaria incidence in areas under epidemiological vigilance.

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