Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-06T18:32:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_RicardodeSouzaRibeiro.pdf: 1191496 bytes, checksum: cdb1da9294c409d1a1f2a403b87cf9c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T18:32:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_RicardodeSouzaRibeiro.pdf: 1191496 bytes, checksum: cdb1da9294c409d1a1f2a403b87cf9c9 (MD5) Previous issue date: 2013 / A malária é uma doença que provoca um enorme impacto em todo mundo e muitos esforços tem sido feitos na tentativa de eliminar esta doença há séculos. O desenvolvimento de uma vacina eficaz contra esta doença se tornou prioridade para muitos grupos de pesquisa, entretanto apenas um antígeno apresentou resultados promissores em ensaios clínicos de fase III. O processo de identificação de candidatos promissores para comporem uma vacina é muito laborioso e demanda um tempo muito grande, principalmente devido à biologia complexa destes parasitos intracelulares. Identificar proteínas nesses tipos de patógenos intracelulares é um grande desafio e requer a análise de diferentes fatores ao mesmo tempo. Um bom candidato a antígeno deve possuir características que façam com que a proteína ou pelo menos parte dela, entre em contato com o sistema imune do hospedeiro em algum momento do ciclo de vida do parasito e que este contato seja capaz de gerar uma resposta imune capaz de neutralizar o parasito e acabar com a infecção. As proteínas secretadas/exportadas se encaixam perfeitamente nessas características e foi justamente com o objetivo de identificá-las que foi desenvolvida uma estratégia automática integrando diferentes programas para buscar estas proteínas. Dessa forma, o proteoma predito de 5 espécies diferentes do gênero Plasmodium foi submetidas à análise de três programas que procuram por características importantes para proteínas exportadas/secretadas nesse gênero. O peptídeo sinal foi investigado utilizando o SignalP, um script em Perl foi desenvolvido para buscar um motivo que é crucial para a exportação de algumas proteínas (PEXEL) e os domínios transmembrana foram buscados utilizando o TMHMM. Algumas proteínas selecionadas foram submetidas à predição de epitopos de células B. Com esta abordagem foi possível identificar algumas famílias de proteínas que já são conhecidas como proteínas exportadas, como Rifin e Stevor, o que mostra que esta abordagem pode ser uma ferramenta útil na identificação de novos prováveis alvos para o desenvolvimento de uma vacina eficaz. Utilizando esta metodologia, esperamos contribuir para aumentar o número de proteínas em testes para formulação de um antígeno que seja capaz de ajudar no controle e erradicação desta doença que causa tantos prejuízos para a humanidade. / Malaria is a disease that causes a huge impact around the world and many efforts have been made in an attempt to eliminate this disease for centuries. The development of an effective vaccine against this disease has become a priority for many research groups, however only one antigen showed promising results in phase III clinical trials. The process of identifying promising candidates to compose a vaccine is very laborious and requires a very long time, mainly due to the complex biology of these intracellular parasites. Identify proteins in these types ofintracellular pathogens is a major challenge and requires the analysis of different factors simultaneously. A good candidate antigen must possess characteristics that make the protein or at least part of it, contact the host immune system at some point in the life cycle of the parasite and that this contact is able to generate an immune response capable to neutralize the parasite and stop the infection. The proteins secreted / exported fit perfectly and it was precisely these characteristics in order to identify them we developed a strategy that automatically integrating different programs to find these proteins. Thus, the predicted proteome of 5 different species of the genus Plasmodium was subjected to analysis of three programs looking for important features for proteins exported/secreted in this genre. The signal peptide was investigated using SignalP, a Perl script was developed to find a subject that is crucial for the export of some proteins (PEXEL) and transmembrane domains using TMHMM were searched. Some selected proteins were subjected to prediction of B cell epitopes With this approach it was possible to identify some protein families that are already known as proteinsexported as Rifin and Stevor, showing that this approach can be a useful tool in identifying new likely targets for the development of an effective vaccine. Using this methodology, we hope to contribute to increasing the number of proteins in tests for formulation of an antigen that is able to help control and eradicate the disease that causes so much harm to humanity.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:12:26Z No. of bitstreams: 1 Bernardo Simões Franklin.pdf: 11748497 bytes, checksum: e1831598c734af4113b0028438c1b84f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T16:12:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernardo Simões Franklin.pdf: 11748497 bytes, checksum: e1831598c734af4113b0028438c1b84f (MD5) Previous issue date: 2009 / Desde sua descoberta, os receptores do tipo Toll (TLRs) têm sido envolvidos em quase todas as doenças que afetam a saúde humana. Seu papel na proteção contra vários patógenos, incluindo protozoários está bem estabelecido. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel dos TLRs na malária. No presente estudo, investigamos o papel dos TLRs durante a malária murina e humana. Nossos resultados mostraram que camundongos com deficiência para MyD88, um adaptador essencial para a sinalização dos TLRs, produzem níveis de citocinas pró-inflamatórias significativamente menores e apresentam sintomas mais amenos durante a infecção por Plasmodium chabaudi. Entretanto, estes animais retêm a capacidade de controlar a parasitemia sugerindo que os TLRs possuam um papel na patogênese e não na proteção contra a malária. Posteriormente, mostramos que ambas, a infecção natural humana por P. falciparum e a experimental murina por P. chabaudi, aumentam a expressão e a responsividade dos TLRs nas células do sistema imune inato. O estado hiper-responsivo das células durante a malária é derivado da ativação de TLR9 e a produção de IFN por células T, levando a uma alta susceptibilidade ao choque séptico durante a malária aguda. Finalmente, em colaboração com a EISAI Research Institute, desenvolvemos um antagonista de TLR9 e testamos seu efeito na Malária Cerebral (CM), uma das manifestações clínicas mais graves da malária. O tratamento oral com este composto inibiu os sintomas, tais como extravasamento vascular cerebral, protegendo camundongos da morte por CM. Em conjunto, nossos resultados mostram um importante papel dos TLRs, especialmente TLR9, na patogênese da malária e que a intervenção na função destes receptores é uma potencial quimioterapia anti-inflamatória contra essa doença. / Toll-like receptors (TLRs) have been involved in almost every know disease that afflict human health so far and their role in resistance to several pathogens, including protozoan parasites, has been well established. The role of TLRs in malaria, however, still remains to be elucidated. Here we studied the role of TLRs in experimental and naturally acquired malaria infection. We showed that mice with deficiency to MyD88, an essential adaptor to TLRs signaling, produce significant lower levels of proinflammatory cytokines and commensurate better clinical outcome upon infection with Plasmodium chabaudi. Nevertheless, these mice can still control parasite loads suggesting that TLRs are involved in pathogenesis rather than protection during malaria. We further studied cellular responsiveness of innate immune responses during human and murine malaria. We showed that both natural acquired P. falciparum infection in humans and experimental infection of mice with P. chabaudi increase TLR expression in innate immune cells causing pro-inflammatory priming of TLR responses. The cellular hyper-responsiveness during Malaria is caused by TLR9 activation and IFN production by T cells conferring high susceptibility to septic shock during the acute disease. Finally, in collaboration effort with EISAI Research Institute, we develop and tested an antagonist of TLR9, on Cerebral Malaria (CM), one of the most severe manifestations of malaria. Oral treatment of mice with this compound inhibited CM symptoms, such as vascular leakage, and prevented death from CM. All together our results show an important role of TLRs, especially TLR9, in malaria pathogenesis and that the therapeutic targeting of TLRs is a potential anti-inflammatory chemotherapy against malaria.

O Antígeno-1 de Membrana Apical (AMA-1) de merozoítas de Plasmodium é um dos principais candidatos a compor uma vacina contra a malária. A função biológica de AMA-1 não é totalmente conhecida, entretanto, existem evidências que sugerem a participação dessa proteína na ligação a eritrócitos de diferentes espécies de Plasmodium. O objetivo deste estudo foi investigar a participação de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) na ligação a eritrócitos humanos utilizando células COS-7 transfectadas com plasmídios recombinantes codificando diferentes regiões do ectodomínio de PvAMA-1. Para isso, os genes que codificam os domínios I-II ou III de PvAMA-1 foram inseridos no vetor pDisplay-EGFP, que permite a expressão das proteínas recombinantes em fusão com a porção N-terminal da Proteína Fluorescente Verde (GFP). Em paralelo, utilizamos construções contendo os genes que codificam a região C-terminal de 19 kDa da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (PvMSP119) e a região II da Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). As quatro construções foram utilizadas para transfectar células COS-7 na presença de lipofectamina. A eficiência das transfecções transientes foi confirmada por imunofluorescência utilizando anticorpos específicos. Em seguida, estudamos a participação dos diferentes domínios de PvAMA-1 na ligação aos eritrócitos. Nossos resultados mostraram que os domínios contíguos I-II, ao contrário do domínio III, foram capazes de se ligar a eritrócitos in vitro. Essa ligação foi específica, pois soros de indivíduos infectados por P. vivax e soros policlonais de camundongos contendo anticorpos anti-PvAMA-1 foram capazes de inibir essa ligação em 82,0% e 79,8%, respectivamente. Além disso, anticorpos monoclonais dirigidos contra o domínio II dessa proteína foram capazes de inibir parcialmente essa ligação. Após o tratamento de eritrócitos com tripsina ou quimiotripsina, estas células perderam grande parte de sua capacidade de ligação, sugerindo que o receptor para PvAMA-1 tenha constituição predominantemente protéica. Em conjunto, nossos resultados podem servir de base para futuros estudos visando um melhor entendimento da função de anticorpos gerados durante a infecção natural ou induzidos após vacinação com PvAMA-1. / The Apical Membrane Antigen (AMA-1) of Plasmodium merozoites is one of the main candidates to be part of a vaccine against malaria. The biological function of AMA-1 is unknown. However, there are evidences that suggest the participation of this protein in the interaction with erythrocytes (RBC) of different Plasmodium species. Using transfected COS-7 cells with recombinant plasmids encoding different portions of the PvAMA-1 ectodomain, our aim was to identify possible domains of PvAMA-1 able to interact with human RBC. The genes that encoded domains I and II in combination or domain III of PvAMA-1 were cloned into the pDisplay-EGFP vector. This vector allows expression of the protein fused to the N-terminus of enhanced green fluorescent protein (GFP). In parallel, we also used constructions containing the genes that encoded the 19 kDa C-terminal region of Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP119) and region II of the Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). Constructions were used to transiently transfect COS-7 cells. The efficiency of expression of all constructs was confirmed by immunofluorescence assay using specific antibodies. After that, we studied the participation of the different domains of PvAMA-1 in the binding to human RBC. We found that COS-7 cells expressing domains I-II, but not domain III, bound to human RBC in vitro. This binding was specific, because sera from malaria-infected patients and mouse polyclonal sera containing antibodies to PvAMA-1 were able to block the adhesion by 82.0% and 79.8%, respectively. Moreover, monoclonal antibodies directed against domain II were partially inhibitory in the cytoadherence assays. The receptor recognized on the surface of COS-7 cells expressing the domains I and II was partially removed after human RBC were treated with trypsin or chymotrypsin, suggesting that its composition is predominantly protein. In conclusion, our results can be used as basis for future studies aimed at better understating the function of the antibodies generated during the natural infection or after vaccination with PVAMA-1.

O Antígeno-1 de Membrana Apical (AMA-1) de merozoítas de Plasmodium é um dos principais candidatos a compor uma vacina contra a malária. A função biológica de AMA-1 não é totalmente conhecida, entretanto, existem evidências que sugerem a participação dessa proteína na ligação a eritrócitos de diferentes espécies de Plasmodium. O objetivo deste estudo foi investigar a participação de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) na ligação a eritrócitos humanos utilizando células COS-7 transfectadas com plasmídios recombinantes codificando diferentes regiões do ectodomínio de PvAMA-1. Para isso, os genes que codificam os domínios I-II ou III de PvAMA-1 foram inseridos no vetor pDisplay-EGFP, que permite a expressão das proteínas recombinantes em fusão com a porção N-terminal da Proteína Fluorescente Verde (GFP). Em paralelo, utilizamos construções contendo os genes que codificam a região C-terminal de 19 kDa da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (PvMSP119) e a região II da Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). As quatro construções foram utilizadas para transfectar células COS-7 na presença de lipofectamina. A eficiência das transfecções transientes foi confirmada por imunofluorescência utilizando anticorpos específicos. Em seguida, estudamos a participação dos diferentes domínios de PvAMA-1 na ligação aos eritrócitos. Nossos resultados mostraram que os domínios contíguos I-II, ao contrário do domínio III, foram capazes de se ligar a eritrócitos in vitro. Essa ligação foi específica, pois soros de indivíduos infectados por P. vivax e soros policlonais de camundongos contendo anticorpos anti-PvAMA-1 foram capazes de inibir essa ligação em 82,0% e 79,8%, respectivamente. Além disso, anticorpos monoclonais dirigidos contra o domínio II dessa proteína foram capazes de inibir parcialmente essa ligação. Após o tratamento de eritrócitos com tripsina ou quimiotripsina, estas células perderam grande parte de sua capacidade de ligação, sugerindo que o receptor para PvAMA-1 tenha constituição predominantemente protéica. Em conjunto, nossos resultados podem servir de base para futuros estudos visando um melhor entendimento da função de anticorpos gerados durante a infecção natural ou induzidos após vacinação com PvAMA-1. / The Apical Membrane Antigen (AMA-1) of Plasmodium merozoites is one of the main candidates to be part of a vaccine against malaria. The biological function of AMA-1 is unknown. However, there are evidences that suggest the participation of this protein in the interaction with erythrocytes (RBC) of different Plasmodium species. Using transfected COS-7 cells with recombinant plasmids encoding different portions of the PvAMA-1 ectodomain, our aim was to identify possible domains of PvAMA-1 able to interact with human RBC. The genes that encoded domains I and II in combination or domain III of PvAMA-1 were cloned into the pDisplay-EGFP vector. This vector allows expression of the protein fused to the N-terminus of enhanced green fluorescent protein (GFP). In parallel, we also used constructions containing the genes that encoded the 19 kDa C-terminal region of Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP119) and region II of the Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). Constructions were used to transiently transfect COS-7 cells. The efficiency of expression of all constructs was confirmed by immunofluorescence assay using specific antibodies. After that, we studied the participation of the different domains of PvAMA-1 in the binding to human RBC. We found that COS-7 cells expressing domains I-II, but not domain III, bound to human RBC in vitro. This binding was specific, because sera from malaria-infected patients and mouse polyclonal sera containing antibodies to PvAMA-1 were able to block the adhesion by 82.0% and 79.8%, respectively. Moreover, monoclonal antibodies directed against domain II were partially inhibitory in the cytoadherence assays. The receptor recognized on the surface of COS-7 cells expressing the domains I and II was partially removed after human RBC were treated with trypsin or chymotrypsin, suggesting that its composition is predominantly protein. In conclusion, our results can be used as basis for future studies aimed at better understating the function of the antibodies generated during the natural infection or after vaccination with PVAMA-1.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3α e MSP-3β foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo α-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3α (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3α and MSP-3β were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of α-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3α (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3α and MSP-3β can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.

Neste estudo avaliamos a resposta imune humoral de indivíduos naturalmente expostos à malária em áreas endêmicas no Brasil. Os anticorpos IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE e IgA anti-formas eritrocitárias de Plasmodium falciparum foram determinadas por ELISA. Anticorpos IgG, IgG1, IgG2 de alta avidez e IgG3 de baixa avidez predominaram nos indivíduos sem complicações de malária ou assintomáticos, enquanto anticorpos IgG4, IgE e IgM predominaram nos indivíduos com complicações clínicas por malária. Os resultados mostram que mesmo em regiões com transmissão instável de malária pode ser observado o desenvolvimento de imunidade protetora quando anticorpos apropriados são produzidos / In this study, we have evaluated the humoral immune response of individuals naturally exposed to malaria living in endemic areas of Brazil. We determined IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE and IgA antibodies against Plasmodium falciparum blood stages by ELISA. We observed that the level of high avidity IgG, IgG1 and IgG2 and low avidity IgG3 antibodies were higher in asymptomatic individuals or with uncomplicated malaria, while IgG4, IgE and IgM antibodies were higher in individuals with complicated malaria. Taken together the results showed that even in unstable malaria regions it can be observed the development of protective immunity against malaria when appropriate antibodies are produced

Neste estudo avaliamos a resposta imune humoral de indivíduos naturalmente expostos à malária em áreas endêmicas no Brasil. Os anticorpos IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE e IgA anti-formas eritrocitárias de Plasmodium falciparum foram determinadas por ELISA. Anticorpos IgG, IgG1, IgG2 de alta avidez e IgG3 de baixa avidez predominaram nos indivíduos sem complicações de malária ou assintomáticos, enquanto anticorpos IgG4, IgE e IgM predominaram nos indivíduos com complicações clínicas por malária. Os resultados mostram que mesmo em regiões com transmissão instável de malária pode ser observado o desenvolvimento de imunidade protetora quando anticorpos apropriados são produzidos / In this study, we have evaluated the humoral immune response of individuals naturally exposed to malaria living in endemic areas of Brazil. We determined IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE and IgA antibodies against Plasmodium falciparum blood stages by ELISA. We observed that the level of high avidity IgG, IgG1 and IgG2 and low avidity IgG3 antibodies were higher in asymptomatic individuals or with uncomplicated malaria, while IgG4, IgE and IgM antibodies were higher in individuals with complicated malaria. Taken together the results showed that even in unstable malaria regions it can be observed the development of protective immunity against malaria when appropriate antibodies are produced

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3α e MSP-3β foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo α-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3α (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3α and MSP-3β were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of α-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3α (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3α and MSP-3β can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.