Streptococcus pneumoniae é responsável por milhões de mortes anuais no mundo todo. As vacinas atuais são baseadas em polissacarídeos capsulares e apresentam cobertura limitada. Assim, diversas proteínas tem sido estudadas como alternativas vacinais, dentre as quais se destacam PspA e PLY. Os objetivos deste estudo foram caracterizar produção de anticorpos e a resposta celular induzida pela imunização com vacinas híbridas PspA-PLY em modelo de pneumonia. Os anticorpos apresentaram elevada capacidade de ligação a pneumococos expressando PspAs de família 2, bem como um aumento na deposição de complemento nestes isolados. A imunização com as proteínas híbridas protegeu os camundongos do desafio sistêmico com pneumococo contendo PspA de família 2. Foi desenvolvido um modelo de pneumonia lobar em camundongos, onde a imunização com PspA-PLY induziu um aumento de IL-6 e TNF nos pulmões após o desafio, levando a uma redução no número de bactérias nos pulmões dos animais. Os dados sugerem que a fusão de PspA à PLY é capaz de ampliar a cobertura protetora a isolados expressando PspAs distintas, e que essa mesma vacina á capaz de proteger os animais contra pneumonia, pela indução precoce de citocinas como IL-6 e TNF-a nos pulmões. / Streptococcus pneumoniae is responsible for millions of deaths annually around the globe. The current vaccines are based on capsular polysaccharides, and have limited coverage. Thus, several proteins have been investigated as alternative vaccines, including PspA and PLY. The present study aimed at characterizing the antibody production and cellular immune response induced by mouse immunization with PspA-PLY hybrid vaccines in a pneumonia model. The induced antibodies demonstrated a strong recognition of pneumococci expressing family 2 PspA molecules, as well as an enhancement in complement deposition in their surface. Immunization with the fusion protein protected mice from systemic challenge with a pneumococcal isolate bearing a family 2 PspA. A model of lobar pneumonia was developed in BALB/c mice, where the immunization with the PspA-PLY fusion induced an increase in IL-6 and TNF-a production in the lungs after pneumococcal challenge, leading to a reduction on bacteria load in the lungs of immunized mice. The data suggests that fusion of PspA to PLY is capable of increasing vaccine coverage aginst pneumococcal infection with isolates bearing family 2 PspAs, and confer protection in mice against pneumonia, by the early production of IL-6 and TNF-a in the lungs.

Streptococcus pneumoniae é responsável por milhões de mortes anuais no mundo todo. As vacinas atuais são baseadas em polissacarídeos capsulares e apresentam cobertura limitada. Assim, diversas proteínas tem sido estudadas como alternativas vacinais, dentre as quais se destacam PspA e PLY. Os objetivos deste estudo foram caracterizar produção de anticorpos e a resposta celular induzida pela imunização com vacinas híbridas PspA-PLY em modelo de pneumonia. Os anticorpos apresentaram elevada capacidade de ligação a pneumococos expressando PspAs de família 2, bem como um aumento na deposição de complemento nestes isolados. A imunização com as proteínas híbridas protegeu os camundongos do desafio sistêmico com pneumococo contendo PspA de família 2. Foi desenvolvido um modelo de pneumonia lobar em camundongos, onde a imunização com PspA-PLY induziu um aumento de IL-6 e TNF nos pulmões após o desafio, levando a uma redução no número de bactérias nos pulmões dos animais. Os dados sugerem que a fusão de PspA à PLY é capaz de ampliar a cobertura protetora a isolados expressando PspAs distintas, e que essa mesma vacina á capaz de proteger os animais contra pneumonia, pela indução precoce de citocinas como IL-6 e TNF-a nos pulmões. / Streptococcus pneumoniae is responsible for millions of deaths annually around the globe. The current vaccines are based on capsular polysaccharides, and have limited coverage. Thus, several proteins have been investigated as alternative vaccines, including PspA and PLY. The present study aimed at characterizing the antibody production and cellular immune response induced by mouse immunization with PspA-PLY hybrid vaccines in a pneumonia model. The induced antibodies demonstrated a strong recognition of pneumococci expressing family 2 PspA molecules, as well as an enhancement in complement deposition in their surface. Immunization with the fusion protein protected mice from systemic challenge with a pneumococcal isolate bearing a family 2 PspA. A model of lobar pneumonia was developed in BALB/c mice, where the immunization with the PspA-PLY fusion induced an increase in IL-6 and TNF-a production in the lungs after pneumococcal challenge, leading to a reduction on bacteria load in the lungs of immunized mice. The data suggests that fusion of PspA to PLY is capable of increasing vaccine coverage aginst pneumococcal infection with isolates bearing family 2 PspAs, and confer protection in mice against pneumonia, by the early production of IL-6 and TNF-a in the lungs.

Streptococcus pneumoniae é causa de doenças como pneumonia, otite, meningite e sepse. As vacinas hoje disponíveis têm cobertura limitada porque são baseadas no polissacarídeo capsular, que varia com os mais de 90 sorotipos da bactéria, além de levarem à substituição de sorotipos na população por outros não presentes nas formulações. Visando reduzir o custo e aumentar a cobertura, têm-se estudado vacinas baseadas em proteínas que ofereceriam proteção independente de sorotipo. Este trabalho teve por objetivo a obtenção, avaliação da estabilidade e da resposta imune em camundongos de híbridos de duas proteínas de S. pneumoniae: a proteína de superfície do pneumococo (PspA) e a pneumolisina geneticamente detoxificada (PdT), sem ou com espaçadores moleculares, rígido ou flexível, entre as moléculas. Os genes dos híbridos com espaçadores foram clonados através da técnica de overlap extension PCR. O gene das proteínas foi expresso em E. coli e as proteínas obtidas foram reconhecidas por anticorpos produzidos contra a célula inteira de pneumococo através de Western Blot. A purificação dos híbridos foi feita utilizando homogeneizador de alta pressão, precipitação de impurezas com detergente catiônico CTAB e diferentes etapas cromatográficas. A estabilidade foi analisada periodicamente através de SDS-PAGE e Western Blot. O híbrido sem espaçador mostrou-se instável, por isso a presença de atividade proteolítica foi investigada através de diversos ensaios para detecção dessas enzimas, mostrando que a instabilidade não decorreu de hidrólise por proteases. Os fragmentos resultantes da quebra tiveram a porção N-terminal sequenciada para identificar o sítio de clivagem, que estava localizado na junção das duas proteínas. Esse sítio foi retirado das construções seguintes e espaçadores moleculares foram incluídos entre os dois antígenos. A molécula com espaçador flexível foi obtida na forma solúvel durante o cultivo, porém durante a purificação ocorreu precipitação irreversível. O clone para produção do híbrido com espaçador rígido permitiu a obtenção da proteína, que foi purificada e teve a estabilidade avaliada periodicamente à 4° C e -20° C por Western Blot empregando anticorpos contra célula inteira de pneumococo, indicando que a introdução do espaçador rígido aumentou a estabilidade do híbrido em relação à molécula sem espaçador. Além disso, diferentes concentrações de estabilizantes foram avaliadas, mostrando que em presença de trealose 1M ou glicerol 50% o híbrido com linker rígido permaneceu estável por pelo menos 4 meses a 4° C. A molécula com espaçador rígido produziu níveis de anticorpos em camundongos comparáveis aos níveis obtidos com a molécula sem espaçador, que foram capazes de proteger 100% dos animais em ensaio de desafio letal intranasal e inibir a atividade hemolítica da pneumolisina. O aumento de estabilidade do híbrido alcançado com a inserção do linker rígido juntamente com a retirada do sítio de clivagem e com a presença de estabilizantes permitem que esta molécula seja utilizada numa vacina pneumocócica proteica. Como estudos vêm demonstrando que seria necessário mais de uma proteína para formular esta nova vacina, a produção deste híbrido traz a grande vantagem de obtenção de dois antígenos em um único processo de produção, o que pode resultar em uma diminuição do custo da dose. / Streptococcus pneumoniae is cause of diseases like pneumonia, otitis, menngitis and sepsis. The vaccines available nowadays has limited coverage because they are based on the capsular polysaccharyde, which varies among the more than 90 bacteria serotypes and they lead to serotype substitution on the population for others not present on the vaccine formulations. In order to reduce the cost and increase the coverage, vaccines based on pneumococcal proteins that would offer serotype independent protection have been studied. The objective of this thesis was the obtainment, stability evaluation and immune response evaluation in mice of hybrids composed of two proteins of S. pneumoniae: pneumococcal surface protein A (PspA) and genetically detoxified pneumolysin (PdT), with or without molecular linkers, rigid and flexible, between the molecules. The genes with molecular linkers were cloned using the overlap extension PCR technique. The genes were expressed in E. coli and the proteins were recognized by anti pneumococcal whole cell in Western Blot. The hybrids were purified using high pressure homogeneizer, precipitation of impurities using cationic detergent CTAB and different chromatography steps. The stability was periodically analyzed through SDS-PAGE and Western Blot. The hybrid without linker was unstable and the presence of proteolytic activity was investigated through several methods for protease activity detection, showing that instability was not due to protease hydrolysis. The N-terminal portion of the degraded protein fragments was sequenced in order to identify the cleavage site, which was localized exactly between the two proteins. This site was removed from the other hybrids and molecular linkers were included between the two antigens. The molecule with flexible linker was obtained on the soluble form during expression, but during purification it precipitated irreversibly. The molecule with rigid linker were expressed, purified and had its stability analyzed periodically at 4° C and -20° C by Western Blot using anti pneumococcal whole cell, indicating that the insertion of the rigid linker increased the hybrid stability when compared with the hybrid without linker. Besides that, different stabilizers in different concentrations were evaluated and it was found that the presence of trehalose 1 M or 50% glycerol stabilized the hybrid with rigid linker for at least 4 months at 4 ° C. The molecule with rigid linker produced levels of antibodies in mice comparable to the hybrid without linker. These antibodies were able to protect 100% of animals from lethal intranasal challenge and inhibit the haemolytic activity of pneumolysin. The stability increase due to the rigid linker together with the removal of the cleavage site and the stabilizers presence allow this hybrid molecule to be used on a novel pneumococcal vaccine. Since studies have shown that it would be necessary more than one protein to formulate this new vaccine, the production of this hybrid brings the great advantage of producing two antigens in one single process, which can decrease the dosage cost.