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Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales très fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés sur 1000 naissances. Elles résultent d’une fermeture incomplète du tube neural lors de l’embryogenèse. L’étiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. La souris représente un outil puissant afin de mieux comprendre la génétique des ATN. Particulièrement, la souris modèle a impliqué fortement la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but d’identifier un nouveau gène causant les ATN. Skam26Jus a été générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractérisée par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phénotype associé aux ATN. La complémentation génétique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante d’un gène de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montré une interaction génétique entre le gène muté chez Skam26Jus et Vangl2, suggérant que ces deux gènes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallèles. Un total de 50% des embryons doubles hétérozygotes avec un phénotype de la queue présentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du génome entier suivie par un clonage positionnel a permis d’identifier Lrp6 comme le gène muté chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a été identifiée dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation était absente dans 30 souches génétiques pures indiquant que cette mutation est spécifique au phénotype observé. Une étude de phénotype-génotype évalue la pénétrance à 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/β-caténine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le séquençage de la région codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a mené à l’identification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrôles et de toutes les bases de données publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathogénicité prédite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bénigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affecté l’habilité de LRP6 d’activer la voie Wnt/β-caténine en utilisant le système rapporteur luciférase de pTOPflash. Nos résultats suggèrent que LRP6 joue un rôle dans le développement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette étude présente aussi Skam26Jus comme un nouveau modèle pour étudier les ATN chez l’humain et fournit un outil important pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des A TN. / Neural tube defects (NTDs) are among the most common congenital malformations in humans affecting 1–2 infants per 1000 births. NTDs are caused by failure of the neural tube to close during embryogenesis. The most common forms of NTDs in humans are anencephaly and spina bifida. Their etiology is complex implicating both environmental and genetic factors. The mouse model represents a powerful tool to investigate the genetics of NTDs. Particularly, mouse mutants at genes belonging to the planar polarity pathway (PCP) developed severe forms of NTDs strongly implicating this pathway in the pathogenesis of NTDs. In this study, we identified and characterized a novel mouse mutant, Skam26Jus, as a model for NTDs. Skam26Jus was generated by N-Ethyl-N-Nitrosuera mutagenesis and displayed a characteristic kinky or loop tail that is considered as the minimal sign if NTDs. Complementation of Skam26Jus mutant with a PCP mouse mutant called Looptail (Lp) showed a genetic interaction between Skam26Jus and Vangl2, the gene mutated in Lp. This led to spina bifida in 50% of double heterozygotes with a kinky or looptail phenotype. Homozygosity mapping followed by a positional candidate gene approach led to the identification of Lrp6 as the gene mutated in Skam26Jus. We detected a homozygous mutation, p.Ile681Arg, in Lrp6 in Skam26Jus mice having loop/kinky tail phenotype. This mutation was absent in 30 inbred strains analyzed indicating that it is disease specific. Genotype-phenotype studies indicated a 52 % penetrance of the p.Ile681Arg mutation. Lrp6 is known to activate Wnt canonical β-catenin pathway and inhibit Wnt non canonical PCP pathway. Sequencing analysis of the open reading frame and exon-intron junctions of human LRP6 in 268 NTD patients led to the identification of 4 novel rare missense mutations that were absent in 272 controls analyzed and in all public databases. These mutations were p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile ; p.Tyr1541Cys, and of these, p.Val1386Iso was predicted to be benign, and p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys and p.Tyr1541Cys were predicted to be possibly pathogenic using bioinformatics tools. Functional validation of these mutations with the luciferase reporter system pTOPflash assay demonstrated that mutation p.Tyr306His, p.Tyr373Cys and iii p.Tyr1541Cys reduced the ability of LRP6 to activate the Wnt canonical β-catenin pathway. Our data suggest that LRP6 could play a role in the development of NTDs in a small fraction of NTD patients. Our study also presents Skam26Jus as a new mouse model for the study of human NTDs and provides an important tool for better understanding of the molecular pathogenic mechanisms underlying NTDs.

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales très fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés sur 1000 naissances. Elles résultent d’une fermeture incomplète du tube neural lors de l’embryogenèse. L’étiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. La souris représente un outil puissant afin de mieux comprendre la génétique des ATN. Particulièrement, la souris modèle a impliqué fortement la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but d’identifier un nouveau gène causant les ATN. Skam26Jus a été générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractérisée par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phénotype associé aux ATN. La complémentation génétique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante d’un gène de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montré une interaction génétique entre le gène muté chez Skam26Jus et Vangl2, suggérant que ces deux gènes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallèles. Un total de 50% des embryons doubles hétérozygotes avec un phénotype de la queue présentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du génome entier suivie par un clonage positionnel a permis d’identifier Lrp6 comme le gène muté chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a été identifiée dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation était absente dans 30 souches génétiques pures indiquant que cette mutation est spécifique au phénotype observé. Une étude de phénotype-génotype évalue la pénétrance à 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/β-caténine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le séquençage de la région codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a mené à l’identification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrôles et de toutes les bases de données publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathogénicité prédite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bénigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affecté l’habilité de LRP6 d’activer la voie Wnt/β-caténine en utilisant le système rapporteur luciférase de pTOPflash. Nos résultats suggèrent que LRP6 joue un rôle dans le développement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette étude présente aussi Skam26Jus comme un nouveau modèle pour étudier les ATN chez l’humain et fournit un outil important pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des A TN. / Neural tube defects (NTDs) are among the most common congenital malformations in humans affecting 1–2 infants per 1000 births. NTDs are caused by failure of the neural tube to close during embryogenesis. The most common forms of NTDs in humans are anencephaly and spina bifida. Their etiology is complex implicating both environmental and genetic factors. The mouse model represents a powerful tool to investigate the genetics of NTDs. Particularly, mouse mutants at genes belonging to the planar polarity pathway (PCP) developed severe forms of NTDs strongly implicating this pathway in the pathogenesis of NTDs. In this study, we identified and characterized a novel mouse mutant, Skam26Jus, as a model for NTDs. Skam26Jus was generated by N-Ethyl-N-Nitrosuera mutagenesis and displayed a characteristic kinky or loop tail that is considered as the minimal sign if NTDs. Complementation of Skam26Jus mutant with a PCP mouse mutant called Looptail (Lp) showed a genetic interaction between Skam26Jus and Vangl2, the gene mutated in Lp. This led to spina bifida in 50% of double heterozygotes with a kinky or looptail phenotype. Homozygosity mapping followed by a positional candidate gene approach led to the identification of Lrp6 as the gene mutated in Skam26Jus. We detected a homozygous mutation, p.Ile681Arg, in Lrp6 in Skam26Jus mice having loop/kinky tail phenotype. This mutation was absent in 30 inbred strains analyzed indicating that it is disease specific. Genotype-phenotype studies indicated a 52 % penetrance of the p.Ile681Arg mutation. Lrp6 is known to activate Wnt canonical β-catenin pathway and inhibit Wnt non canonical PCP pathway. Sequencing analysis of the open reading frame and exon-intron junctions of human LRP6 in 268 NTD patients led to the identification of 4 novel rare missense mutations that were absent in 272 controls analyzed and in all public databases. These mutations were p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile ; p.Tyr1541Cys, and of these, p.Val1386Iso was predicted to be benign, and p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys and p.Tyr1541Cys were predicted to be possibly pathogenic using bioinformatics tools. Functional validation of these mutations with the luciferase reporter system pTOPflash assay demonstrated that mutation p.Tyr306His, p.Tyr373Cys and iii p.Tyr1541Cys reduced the ability of LRP6 to activate the Wnt canonical β-catenin pathway. Our data suggest that LRP6 could play a role in the development of NTDs in a small fraction of NTD patients. Our study also presents Skam26Jus as a new mouse model for the study of human NTDs and provides an important tool for better understanding of the molecular pathogenic mechanisms underlying NTDs.

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des anomalies développementales où le tube neural reste ouvert (1-2/1000 naissances). Afin de prévenir cette maladie, une connaissance accrue des processus moléculaires est nécessaire. L’étiologie des ATN est complexe et implique des facteurs génétiques et environnementaux. La supplémentation en acide folique est reconnue pour diminuer les risques de développer une ATN de 50-70% et cette diminution varie en fonction du début de la supplémentation et de l’origine démographique. Les gènes impliqués dans les ATN sont largement inconnus. Les études génétiques sur les ATN chez l’humain se sont concentrées sur les gènes de la voie métabolique des folates du à leur rôle protecteur dans les ATN et les gènes candidats inférés des souris modèles. Ces derniers ont montré une forte association entre la voie non-canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) et les ATN. Le gène Protein Tyrosine Kinase 7 est un membre de cette voie qui cause l’ATN sévère de la craniorachischisis chez les souris mutantes. Ptk7 interagit génétiquement avec Vangl2 (un autre gène de la voie PCP), où les doubles hétérozygotes montrent une spina bifida. Ces données font de PTK7 comme un excellent candidat pour les ATN chez l’humain. Nous avons re-séquencé la région codante et les jonctions intron-exon de ce gène dans une cohorte de 473 patients atteints de plusieurs types d’ATN. Nous avons identifié 6 mutations rares (fréquence allélique <1%) faux-sens présentes chez 1.1% de notre cohorte, dont 3 sont absentes dans les bases de données publiques. Une variante, p.Gly348Ser, a agi comme un allèle hypermorphique lorsqu'elle est surexprimée dans le modèle de poisson zèbre. Nos résultats impliquent la mutation de PTK7 comme un facteur de risque pour les ATN et supporte l'idée d'un rôle pathogène de la signalisation PCP dans ces malformations. / Neural tube defects (NTDs) are among the most common congenital defects with a high incidence of 1-2 per 1000 births, causing a heavy burden to both the families and society. Various types of NTDs result from defects happening in the neurulation process during vertebrate embryonic development. In order to prevent the occurrence of NTDs, understanding the underlying mechanism is a prerequisite. The etiology of NTDs is complex involving environmental and genetic factors. Folic acid supplementation was proven to efficiently decrease the frequency of NTDs by 50-70% depending on the time point of this supplementation and demographic background. Gene identification studies in NTDs have adopted mainly a candidate gene approach investigating folate-related genes and genes derived from animal models. In particular, studies in mouse models have demonstrated a strong association between the non canonical Wnt/Planar Cell Polarity (PCP) pathway and NTDs. Protein Tyrosine Kinase 7 (PTK7) is a member of the PCP pathway and was shown to cause a very severe form of NTDs called craniorachischisis in a mouse model. Ptk7 genetically interacts with a core PCP member Vangl2 where double heterozygotes suffer from spina bifida. These data make PTK7 a strong candidate for NTDs in humans. We sequenced the coding region and the exon-intron junctions of PTK7 in a cohort of 473 patients affected with various forms of open and closed NTDs. Novel and rare variants (<1%) were genotyped in a cohort of 473 individuals. Their pathogenic effect was predicted in silico and functionally in an overexpression assay in a well established zebrafish model. We identified in our cohort 6 novel rare mutations, 3 of which are absent in all public databases, in 1.1% of our NTD cohort. One variant, p.Gly348Ser, acted as a hypermorph when overexpressed in the zebrafish model. Our findings implicate mutation of PTK7 as a risk factor for NTDs and provide additional evidence for a pathogenic role of PCP signaling in these malformations.

La Polarité Cellulaire Planaire (PCP) est une voie de signalisation originellement identifiée chez les invertébrés pour son rôle dans l’établissement d’une asymétrie cellulaire perpendiculaire à l’axe apico‐basal. Elle définit une polarité dans le plan d’un épithélium et coordonne cette polarité dans tout l'épithélium. L'activation de la voie PCP conduit à une réorganisation ducyto squelette en passant par une modulation des zones d'adhésion, régulant ainsi la forme et les mouvements des cellules. La voie de signalisation de la PCP est conservée tout au long de l'évolution jusqu'au mammifères, et contrôle la morphogénèse de divers tissus dont les tissus épithéliaux et mésenchymateux, ainsi que pour les tissues cardiaques, osseux, pulmonaire ou encore rénaux, mais aussi le système nerveux pour n'en citer que quelques‐uns.Afin d'identifier le rôle de vangl2, un des gènes centraux de la PCP, dans la mise en place de la circuiterie hippocampale, nous avons créé un modèle murin où vangl2 est supprimé de façon conditionnelle (cKO) dans le télencéphale à des stades précoces de l’embryogénèse. J’ai d'abord montré que Vangl2 est enrichi dans les neurones immatures de la zone sous granulaire du DG, ainsi que dans l’arborisation des neurites (axones et dendrites) des cellules granulaires (CG) du gyrus denté (DG) de l’hippocampe. Ainsi, Vangl2 est enrichi dans le stratum lucidum (sl), une région dense en contacts synaptiques entre le DG et le CA3. Dans cette région a lieu une synapse très particulière entre l'axone des CG, la fibre moussue (Mf) qui forme des boutons géants (MfB) et les excroissances épineuse (TE) issues de la partie proximale des dendrites apicaux. L'analyse structurale et ultra structurale de ces épines démontre que l'élargissement et la complexification de la synapse MfB/TE est bloquée dans nos mutants, alors que les zones actives (PSD) des épines sont présentes, mais réorganisées. De façon intéressante,dans une zone plus distale des dendrites des neurones du CA3 (sl), les épines sont, elles, plus grosses, suggérant un remodelage complexe du réseau en l'absence de vangl2. Enfin, j’ai pu montrer que ces défauts morphologiques étaient corrélés à des problèmes de mémoire complexe (mémoire déclarative) qui dépendent de l’hippocampe mais aussi du cortex. Cette étude montre pour la première fois l’importance du signal PCP dans maturation in vivo d’un circuit hippocampique spécifique ainsi que ces conséquences cognitives. D'autres résultats in vitro montrent que la suppression de vangl2 augmente la vitesse de déplacement des cônes de croissance sur des substrats de N‐cadhérine. J’ai utilisé la microscopie en super résolution spt‐PALM‐TIRF pour montrer que cette augmentation de croissance est inversement proportionnelle à la vitesse du flux rétrograde d’actine. Des expériences de FRAP permettent de suggérer que les molécules de N‐cadhérine engagées dans des interactions hémophiliques (adhésion) est plus importante dans les mutants vangl2 Je propose que Vangl2 contrôle le recyclage et la stabilité des protéines N‐cadhérine dans les sites d’adhésion afin de réguler localement les dynamiques d’actine et par conséquent la croissance neuronale. / Planar Cell Polarity (PCP) is a signaling pathway originally known for its role in the establishment of cellular asymmetry perpendicular to the apico‐basal axis, in the plane of an epithelium. PCPsignaling has been shown to be crucial for many tissue patterning, including epithelial and mesenchymal tissue, but also cardiac, lung, bone, or kidney tissues, to cite a few. PCP signaling controls the regulation of cellular movement via the control of adhesion turnover and cytoskeleton reorganization. Vangl2 is one of the most upstream core PCP proteins that has been implicated in the recent years in various neuronal mechanisms, such as axonal guidance, dendrite morphogenesis or synaptogenesis. However, most of these studies rely on acute downregulation of the gene in vitro or in the use of a mouse presenting a spontaneous mutation of this gene, called Loop‐tail (Vangl2Lp) which causes the death of the embryo at birth. Moreover, the Vangl2Lp form of this protein has been described has a dominant‐negative form, making it difficult to untangle the molecular mechanism leading to the many phenotypes (included neuronal ones) reported inhomozygotes Looptail mice. To bypass this problem we created a conditional knockout (cKO) mouse in which vangl2 is deleted in the telencephalon during early embryogenesis. First, I analyzed the profile of expression of the protein during the first 3 weeks after birth, and I show that Vangl2 is specifically targeted to the arborization of granular cells (GC) of the dentate gyrus (DG) of the hippocampus, and excluded from cell bodies. Also, the protein was highly enriched in immature neurons of the subgranular zone of the DG, and in the stratum lucidum, a region of high‐density contacts between the GC and the CA3. In this region, a special type of synapse is formed: the Mossy Fiber Bouton (MfB) / Thorny Excrescence (TE) synapse. These synapses are bigger and more complex than conventional synapses. I then performed a structural and ultrastructural analysis of the DG/CA3 circuit in the Vangl2 cKO mice in order to understand the role of Vangl2 in the hippocampus maturation. For this, I used stereotaxic mice infection viruses, and Serial block face scanning electron microscopy (SBFsEM) with 3D reconstruction. Results show that in cKO mice, Mfs fasciculation is mildly impacted, and that the enlargement and complexification of the MfB/TE synapse is arrested, with TEs almost absent. I was able to link these morphological abnormalities to deficits in complex hippocampal‐dependent learning tasks. This work demonstrates for the first time the importance of PCP signaling for the in vivo maturation of a specific hippocampal circuit and its specific cognitive consequences. Next, I attempted to identify the functional consequences of vangl2 deletion on young hippocampal neuron maturation. My results confirm that Vangl2 is expressed in young hippocampal neurons and that the deletion of the gene affected neurite outgrowth on Ncadherin substrate. I used spt‐PALM‐TIRF super‐resolution microscopy to show that this increased neurite outgrowth was inversely proportional to a decrease in actin retrograde flowand to a decrease in the number of directed actin trajectories. These results strongly suggest that N‐cadherin adhesions are affected by Vangl2 deletion. FRAP experiments demonstratedthat in Vangl2 cKO neurons the recovery of N‐cadherin molecules engaged in homophilicbindings (adhesion) was decreased, suggesting that the turnover of N‐cadherin involved inadhesion is reduced. Altogether, I propose that Vangl2 controls the turnover/stability of Ncadherin proteins at adhesion sites to regulate local actin dynamics and consequently neuronal outgrowth