The effects of 1,25(OH)2D3, PTH and 25(OH)D3 on phosphate or calcium uptake were studied in cultured, adherent chick enterocytes over a period of 10 min after hormone addition. Time course studies of cells treated with 130 pM 1,25(OH)2D3 showed an increase in 32P uptake as early as 3 min. Similar studies with 65 pM bPTH(l1-34) resulted in an increase in 45Ca uptake only if the cells had been cultured in serum. (OH)D3, which is not firmly established as an active metabolite of vitamin D, was shown to increase 45Ca uptake within 5 min at a 100 nM concentration. Analyses of signal transduction events involving each hormone were undertaken using PKC and PKA inhibitors, chelerythrine and Rp-cAMP, respectively. In the presence of PKC inhibitor and 1,25(OH)2D3 elevated 32P levels were apparent; however, further investigations involving efflux studies showed PKC inhibition of 32P extrusion in the presence or absence of hormone. On the other hand, suppression of the PKA pathway stimulated an increase in 1,25(OH)2D3-mediated 32P uptake. Preincubation of enterocytes with Ab099 against a putative membrane receptor for 1,25(OH)2D3 abolished steroid-stimulated 32P uptake. While PKC inhibition had no effect on 45Ca uptake in enterocytes exposed to 65 pM bPTH(1-34) in serum, pretreatment with PKA inhibitor resulted in 45Ca levels relatively close to basal levels. Cells pretreated with PKC inhibitor and exposed to 25(OH)D3 demonstrated no changes in 45Ca levels, whereas inhibition of PKA induced decreased 45Ca levels after 10 min of incubation. In equivalent time course studies of membrane trafficking using confocal microscopy, potential vectorial transport initiated by each hormone was analyzed with agonist alone or in the presence of PKC and PKA inhibitors. In addition 1,25(OH)2D3 was tested in the presence of Ab099 against its putative membrane receptor. Visualization of these experiments using the endocytotic marker dye, FM 1-43, demonstrated that hormone-mediated membrane trafficking is rapid enough to contribute to ion transport. These results also suggest that vectorial vesicular transport mechanisms were involved to some extent in response to each hormone. Moreover, the pattern for membrane trafficking was different for each agonist. These combined results indicate that adherent chick enterocytes demonstrate hormone-mediated uptake that occurs more rapidly than cells in suspension or in perfusion studies. This research supports previous studies that identify 25(OH)D3 as an active vitamin D metabolite. The PKA signal transduction pathway is a possible mechanism for PTH- and 25(OH)D3-mediated increases in 45Ca. In addition, a central role for the basal lateral membrane receptor protein, 1,25(OH)2D3MARRS-bp, in 1,25(OH)2D3-mediated 32P uptake is supported. Confocal imaging suggests that the transport mechanism for phosphate or calcium ions in the presence of these hormones involves vesicular carriers.

Darmepithelzellen entwickeln eine spezielle apikale Oberfläche zur Aufnahme von Nährstoffen aus dem Darminhalt. Diese Oberfläche besteht aus F-Aktin Protrusionen und werden als Mikrovilli (MV) bezeichnet. MV regulieren die kommensalen Bakterien und schützen die inneren Gewebe gegen den Angriff pathogener Mikroorganismen. Dennoch kann das Enteropathogen Salmonella enterica (Salmonella) die MV auslöschen und zerstört durch sein Typ-3-Sekretionssystem und dessen sekretierte Virulenzsproteine die Epithelschicht. Diese Virulenzproteine werden in das Zytoplasma der Wirtzellen injiziert und führen während des Eindringens von Salmonella zur F-Aktin Umlagerung. Durch Untersuchungen des Einflusses einiger T3SS-1 Effektorproteine auf die Zerstörung der MV konnte nachgewiesen werden, dass allein die Translokation von SopE die MV-Auslöschung verursachte und ausreichend für die Wiederherstellung der Invasion war. Echtzeitlebend-zellmikroskopie zeigte, dass MV ausgelöscht werden während Membranausstülpungen (Ruffles) gebildet werden. Diese Ruffle-Bildung vereinfachte ein paralleles Eindringen nicht-invadierender Stämme von Salmonella. Es konnte beobachtet werden, dass die Ausschaltung von Villin und Myosin 1a durch shRNA in C2BBe1 Zellen die Invasionsrate von Salmonella ermäßigte. Darüber hinaus wurde Ezrin zu den intrazellulären Bakterien aber nicht zur apikalen Seite rekrutiert. Außerdem verhinderte die durch das SopE verursachte Umlagerung des F-Aktins, welche die MV-Auflösung zur Folge hatte, die Makropinozytose der infizierten Zellen. Es lässt sich daraus schließen, dass die Zerstörung der MV für eine effiziente Invasion von Salmonella nötig ist. Die F-Aktin Umlagerung begünstigt zudem das Eindringen von nicht-invadierenden Bakterien. Des Weiteren benötigt Salmonella MV-Proteine zur F-Aktin Polymerisierung und Invasion in polarisierten Epithelzellen, was die Makropinozytose der Zellen beeinträchtigt. Möglicherweise tragen diese Phänotypen zur Infektion in vivo bei und verursachen das klinische Bild des Durchfalls.