The thesis deals with molecular detection of resistance in populations of pollen beetle based on genetic polymorphisms in the VSSC gene of this pest. Population samples were collected in 2016-2018 in the Czech Republic, mainly in the Southwestern Bohemian Region. A total of 57 populations of pollen beetles with different degrees of resistance were analyzed. Nucleotide mutations of populations were monitored in two parts of the VSSC gene of pollen beetles - DIIS4 - S5 linker / DIIS5 and DIIIS6 gene, which is located in the VSSC binding domain. These parts were amplified and sequenced by the Sanger method. In the alignment of final sequences, mutations were searched. After that, the effect of these mutations on the amino acid sequence was determined and the effect on the resulting VSSC protein conformation was assessed.

Research aim and objectives. To investigate species diversity of pollen beetles (Meligethes s.l.) in WOSR and SOSR crops during flowering stage and to evaluate the resistance of pollen beetle (M. aeneus) to pyrethroid class insecticides. Research objectives: ● To estimate species diversity of pollen beetles (Meligethes s.l.) in WOSR and SOSR agrocenoses during flowering stage in the regions of intensive oilseed rape growing by morphologic and molecular (DNA sequencing) methods and to evaluate the species diversity (Simpson’s) index; • To evaluate the genetic diversity of the most common species of pollen beetles (Meligethes s.l.) in oilseed rape agrocenoses and to compare them with the deponated data in the GenBank; • To evaluate the resistance of populations of pollen beetle (M. aeneus), collected from different regions, to active substances of pyrethroid class insecticides: λ- cyhalothrin, α- cypermethrin, deltamethrin and tau – fluvalinate by IRAC (Insecticide Resistance Action Committee) method and to determine the variation in the resistance of pollen beetle during the research period; • To determine the resistance of pollen beetle (M. aeneus) to pyrethroid class insecticides in the field conditions; • To determine the effectiveness of insecticides with different modes of action (pyrethroid, neonicotinoid, phosphorus-organic) against pollen beetle (M. aeneus) in the field conditions and to evaluate their effect on the productivity of WOSR and SOSR. Scientific novelty of... [to full text] / Tyrimų tikslas ir uždaviniai. Ištirti žiedinukų (Meligethes s.l.) rūšinę sudėtį žieminių ir vasarinių rapsų pasėliuose žydėjimo tarpsniu, atskirų rūšių išplitimą bei įvertinti rapsinio žiedinuko (M. aeneus) atsparumą piretroidų klasės insekticidams. Tyrimų uždaviniai: • Nustatyti žiedinukų (Meligethes s.l.) rūšinę sudėtį žieminių ir vasarinių rapsų agrocenozėse žydėjimo tarpsniu intensyvaus rapsų auginimo regionuose morfologiniu ir molekuliniu (DNR sekoskaitos) metodais bei įvertinti žiedinukų (Meligethes s.l.) rūšių išplitimo indeksą; • Įvertinti dažniausiai aptinkamų rapsų agrocenozėse žiedinukų (Meligethes s.l.) rūšių genetinį polimorfizmą bei palyginti su Genų banke deponuotais duomenimis; • Įvertinti rapsinio žiedinuko (M. aeneus) populiacijų iš skirtingų regionų atsparumą piretroidų klasės insekticidų veikliosioms medžiagoms: lambda-cihalotrinui, alfa-cipermetrinui, deltametrinui ir tau-fluvalinatui IRAC metodu bei nustatyti rapsinio žiedinuko atsparumo pokyčius per tyrimų laikotarpį; • Nustatyti rapsinio žiedinuko (M. aeneus) atsparumą piretroidų klasės insekticidams lauko sąlygomis; • Nustatyti skirtingų klasių insekticidų (piretroidų, neonikotinoidų, fosforoorganinių junginių) veiksmingumą nuo rapsinio žiedinuko (M. aeneus) lauko sąlygomis bei įvertinti jų poveikį žieminių ir vasarinių rapsų derlingumo rodikliams. Mokslinis darbo naujumas. Morfologiniu bei DNR sekvenavimo metodais nustatyta Meligethes s.l. populiacijų rūšinė sudėtis bei įvertintas rūšių išplitimas... [toliau žr. visą tekstą]

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Les insectes phytophages causent des dommages importants aux cultures. Ces insectes sont principalement contrôlés par l’utilisation d’insecticides mais les effets néfastes des composés utilisés sur la santé humaine et l’environnement ainsi que l’apparition de populations résistantes à ces composés imposent de trouver des stratégies de lutte alternatives. Sélectionner des plantes pour leur résistance aux insectes pourrait être une solution intéressante. Un frein majeur au développement de cette stratégie est le fait qu’un grand nombre de génotypes doit être criblé pour identifier des sources de résistance et que le phénotypage est souvent complexe et limite les possibilités de criblage à grande échelle. Pour lever ces verrous, il est important de comprendre les mécanismes à l’origine des résistances. Une fois ces mécanismes précisés dans le cadre de l’interaction entre une culture et un ravageur, l’identification de traits clés de cette interaction permet d’envisager l’utilisation de biomarqueurs de la résistance qui peuvent fortement simplifier le phénotypage. Ce type d’approche a été conduit au cours de cette thèse dans le cadre de l’interaction entre le colza (Brassica napus) et l’un de ses principaux ravageurs, le méligèthe (Brassicogethes aeneus). Des travaux antérieurs avaient mis en évidence l’existence de certains composés biochimiques présents dans le périanthe des boutons floraux et corrélés au niveau d’attaque de différents génotypes de colza. Ces résultats avaient été obtenus au laboratoire et il était nécessaire de les confirmer dans des conditions de culture réalistes. Le premier objectif de cette thèse était donc de développer une méthode permettant de cribler au champ différents génotypes de colza pour leur résistance au méligèthe afin de valider ou non le potentiel des composés biochimiques identifiés précédemment comme biomarqueurs mais aussi d’en identifier de nouveaux. Le second objectif de ce travail était de mieux comprendre l’écologie alimentaire du méligèthe afin d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour la sélection de plantes résistantes. Nous avons mené plusieurs expérimentations sur le terrain qui nous ont permis de développer une méthode de crible au champ des génotypes de colza pour leur résistance au méligèthe. Cette méthode a mis en évidence l’existence de différences de résistance fortes et robustes entre génotypes parmi une gamme de 19 génotypes testés. Les biomarqueurs potentiels précédemment identifiés n’ont pas été validés au champ mais deux autres composés semblent influencer la résistance au méligèthe et pourraient être utilisés comme futurs biomarqueurs. Ces expériences au champ ont aussi permis de montrer que la biochimie des périanthes était très dépendante des conditions environnementales, ce qui pourra compliquer le travail de sélection. Par ailleurs, des expériences de développement réalisées en conditions contrôlées ont montré que le méligèthe utilisait le nectar présent dans les fleurs de colza mais que celui-ci ne semblait pas affecter son développement. Le pollen semble, jouer un rôle important sur son développement mais les larves parviennent à se développer sans son apport. Les expériences sur le comportement alimentaire du méligèthe adulte ont montré que cet insecte avait un patron d’attaque spécifique sur les inflorescences de colza en s’alimentant avant tout sur les boutons de petite taille (donc moins riches en pollen par rapport aux gros). Il semble que la disponibilité mais surtout l’accessibilité du pollen médiée par le périanthe joue un rôle essentiel dans le comportement de cet insecte. Ce travail a permis de mieux comprendre le comportement alimentaire du méligèthe et d’identifier des traits importants pour son développement. Ce travail montre que des résistances modérées existent au sein du colza et qu’elles pourraient être utilisées pour la sélection variétale. Il pointe aussi les limites des approches basées sur des biomarqueurs biochimiques. / Herbivorous insects cause important yield losses to crops. These insects are mainly managed through insecticides but negative effects of used compounds on the human health and the environment as well as the development of resistant pest populations impose finding alternative strategies to manage them. Breeding plants for enhanced resistance to insects is an attractive strategy. This kind of strategy was already implemented to manage insects but examples of its utilisation remain rare. The main limitation of this strategy is that a large number of genotypes needs to be screened through generally complex phenotyping methods to identify resistances. To circumvent these issues, an approach based on the understanding of plant defence mechanisms and the utilisation of biochemical biomarkers linked to resistance could be interesting. During this PhD, this kind of approach was developed on the oilseed rape (Brassica napus) and one of its main pests, the pollen beetle (Brassicogethes aeneus). Previous studies identified chemical compounds present in the perianth of flower buds and correlated to oilseed rape resistance to pollen beetle. However these studies were carried out in the laboratory and need to be validated in field conditions. Moreover, information on pollen beetle feeding ecology are still lacking while they could help identifying new targets for breeding. The first objective of this PhD is to develop a method allowing to screen resistance to the pollen beetle in the field. This method will allow to confirm the potential biomarkers previously identified and to look for additional biomarkers. The second objective of the present work was to better understand key steps in the interaction between the pest and its host plant to identify potential new target traits for resistance. For this purpose, the importance of food sources present in flowers such as pollen and nectar on pollen beetle development and the factors impacting the feeding pattern of adults on the inflorescence were investigated. We conducted field experiments in two different sites and for two consecutive years and propose a method allowing to screen oilseed rape resistance to pollen beetle in the field. Using this method, we were able to identify genotypes with moderate levels of resistance among a set of 19 genotypes. Previously identified biochemical biomarkers were not correlated with plant resistance in the field but new markers were identified (i.e. quinic acid and arginine). Our field experiments also showed that plant composition is highly variable according to the environment and this variability could affect usefulness of these markers during plant breeding programs. Experiments under controlled conditions also showed that pollen beetle used nectar for feeding but that it did not seem to affect its development. Pollen, on the other hand, seemed to have a more important impact but was not indispensable to pollen beetle development. The study of the pollen beetle feeding behaviour showed that this insect has a surprising feeding pattern on oilseed rape inflorescences and that small buds are more used for feeding than large buds that contain more pollen. It seems that accessibility and to a lesser extend availability of feeding resource explain this pattern and that the perianth has a major role on this preference. These experiments allowed to better understand the pollen beetle feeding ecology and to identify plant traits important for its development. Our work showed that moderate levels of resistance are present in oilseed rape and could be used in breeding programs. Limitations of approaches based on biochemical biomarkers are discussed.

Les plantes possèdent de multiples systèmes de défense contre les insectes phytophages. Dans un contexte agronomique, manipuler ces défenses au moyen de la sélection pourrait contribuer à réduire les dommages causés par les insectes ravageurs en augmentant la résistance naturelle des plantes. Cette stratégie se heurte cependant à des contraintes très fortes lorsqu'il s'agit de l'appliquer aux insectes. Après avoir détaillé ces contraintes, nous proposons une démarche alternative aux méthodes classiques. Celle-ci vise à identifier des traits-clés de la plante qui modulent son interaction avec le ravageur. Si de tels traits sont identifiés et validés expérimentalement, ils permettront ensuite de conduire la sélection sans nécessiter d'insecte. Nous avons testé cette démarche dans un système composé du colza (Brassica napus) et du méligèthe Meligethes aeneus, un ravageur majeur de cette culture. Le méligèthe est un coléoptère pollinivore dont les adultes sont généralistes mais ne pondent que sur certaines brassicacées. Les dégâts agronomiques sont causés par ces adultes qui, avant que la floraison ne démarre, détruisent les boutons floraux pour atteindre le pollen qu'ils contiennent. Quatre étapes cruciales de l'interaction ont été étudiées : l'attraction à distance, l'alimentation des adultes, la production et la ponte des œufs, et le développement larvaire. Six génotypes de colza ont été comparés dans une série d'expérimentations au laboratoire. La mise en relation des résultats de préférence/performance de l'insecte avec des profilages métaboliques larges de tissus floraux a permis d'identifier des traits-clés candidats. Les conclusions principales de ce travail sont (i) que la composition biochimique du périanthe est déterminante dans la stimulation de l'alimentation des adultes, et que cette stimulation pourrait être largement sous l'influence d'un petit nombre de composés dont le saccharose ; (ii) que cette stimulation détermine de façon majeure, par un effet domino, la production d'œufs en contraignant l'ovogenèse ; (iii) que la qualité nutritionnelle du pollen impacte à la fois les larves et les adultes, et que cette qualité pourrait être déterminée en bonne partie par la concentration en amidon et en certains glucosinolates (des métabolites secondaires typiques de quelques familles végétales dont les brassicacées). La combinaison des différents résultats obtenus permet également de proposer des hypothèses plus générales, parmi lesquelles le fait que le contexte agronomique dans lequel l'interaction a lieu ait largement influencé, voire perturbé, l'interaction qui liait le méligèthe et les brassicacées sauvages avant que les cultures de colza ne se généralisent. Cette thèse a montré qu'une nouvelle voie était peut-être envisageable pour contribuer à protéger les cultures de façon durable contre les insectes ravageurs, en particulier pour les systèmes agronomiques où les dégâts sont causés à un stade temporairement sensible de la culture. / Plants display multiple defense systems against phytophagous insects. Manipulating these defenses by means of selection could contribute to decrease damages caused by insect pests, by increasing natural resistance of crops. This strategy faces great constraints when applied to insects. We first detail these constraints and then propose an alternative approach to classical methods. It consists in identifying key plant traits that determine the intensity of the interaction between the plant and the pest. If such traits are identified, selection could be conducted on the basis if these sole traits, without needing any insect. We tested this approach in a system composed of oilseed rape (Brassica napus) and the pollen beetle (Meligethes aeneus), a major pest of this culture. This coleopteran generalist pollen feeder lays eggs only on certain brassicaceous plants. Agronomical damage arise before plant flowering and are caused by adults, which destroy flower buds to get the pollen they contain. Four crucial steps of the interaction were studied: attraction, adult feeding, egg production and oviposition, and larval development. Six oilseed rape genotypes were compared in a series of experiments conducted in the laboratory. By linking insect preference/performance to large metabolic profiling of bud tissues, we identified candidate key traits. Main conclusions of this work are (i) that biochemical composition of the perianth, especially a few compounds among which sucrose, is determinant for feeding intensity; (ii) that feeding stimulation has an important impact on egg production by constraining oogenesis; (iii) that pollen nutritional quality, probably mostly determined by starch and some glucosinolates, interacts with both pollen beetle larvae and adults. Combination of several results also allows drawing more general hypotheses about the oilseed rape - pollen beetle interaction. One of these is that the agronomical context in which the interaction takes place may have largely influenced, or even disturbed, the interaction that linked this insect and wild brassicaceous plants before oilseed rape cultivation. This thesis showed that a new way might be possible to protect cultures against insect pests. It could be both efficient and sustainable, especially in systems where agronomical damage is caused at a temporary vulnerable plant stage.

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