Bone mechanotransduction is a fundamental process underlying the remarkable ability of bones to perceive surrounding physical cues and adapt their mass, structure and overall strength to their mechanical environment. Therefore, it is central to many aspects of bone biology and disease. The key to a mechanistic understanding of this process lies in better knowledge of critical signaling molecules that relay the mechanical information inside bone cells. In this thesis, we investigate the role of polycystin-1 (PC1), a proposed fluid flow sensor in kidney epithelial cells, in transducing mechanical signals in bone cells. Loss of PC1 in osteoblast lineage cells using osterix-Cre (Osx-Cre) causes mild osteopenia in mice with reduced calvarial and trabecular bone formation, and markedly attenuated anabolic bone formation responses to in vivo mechanical loading of long bones. Loss of PC1 in limb bud mesenchymal cells at an early stage causes mildly increased bone formation and a tendency to exhibit enhanced anabolic responses to in vivo mechanical loading of long bones. These findings suggest that PC1 has a complex role in different bone cell populations both during development and in bone mechanotransduction. PC1 has been shown to mediate tensile force-induced proliferation in osteoprogenitor cells (OPCs) in craniofacial sutures. To investigate the role of PC1 in periosteal osteoprogenitor mechanotransduction, we establish a shockwave-induced periosteum mechanical stress model. Shockwave treatment triggers dramatically increased cell proliferation, potent osteogenic activity, and intramembranous new bone formation in the periosteum. We show that loss of PC1 in periosteal cells (Prx1-Cre) does not affect periosteal mechanoresponsiveness to shockwave mechanical stress. These findings suggest that the role of PC1 in OPCs is likely tissue or force dependent. Fluid shear stress (FSS) in the lacunar-canalicular network is a major force element that osteocytes experience and respond to in vivo. To study the role of PC1 in FSS-mediated osteocyte/osteoblast mechanotransduction, we establish a laminar FSS system with custom-made flow chambers and a PC1-deficient osteoblast cell line. Our data show that PC1 is essential for regulation of FSS-induced initial \(Ca^{2+}\) influx in osteoblasts and mediates osteoblast FSS responses in a COX-2 and AP-1 independent manner.

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est une maladie génétique rénale qui se manifeste par le développement de kystes au rein. Elle résulte de mutations dans le gène PKD1/polycystine-1 (PC-1), contenant un motif coiled-coil et dans le gène PKD2/PC-2 dont les fonctions restent à élucider. À partir d’un chromosome artificiel bactérien, le gène Pkd1 murin (BAC-Pkd1) a été modifié afin de générer 4 lignées de souris transgéniques délété du motif coiled-coil Pkd1Δcoiled-coil et 3 lignées contrôles Pkd1TAG possédant 1-35 copies du transgène. Ces 2 transgènes ont un profil d’expression identique à l’endogène et le niveau dépend du nombre de copies. Alors que les souris Pkd1TAG développent la PKRAD de sévérité proportionnelle au niveau d’expression, les lignées Pkd1Δcoiled-coil en sont épargnées. Ces résultats démontrent l’importance du motif coiled-coil dans la maladie. Les souris Pkd1Δcoiled-coil croisées par Pkd1-/- (létale à la naissance), Pkd1-/- ; Pkd1Δcoiled-coil survivent après la naissance et permettent d’analyser in vivo les interactions, la signalisation et le rôle physiologique du motif coiled-coil. Ces souris Pkd1-/- ; Pkd1Δcoiled-coil avec une copie du transgène présentent des kystes rénaux et meurent ~2 semaines alors que celles à hautes copies n’ont aucun phénotype comme les Pkd1TAG. Les résultats génétiques et biochimiques démontrent que Pc-1Δcoiled-coil est hypomorphe. Bien que Pc-1Δcoiled-coil subit son clivage autoprotéolytique, l’analyse du transport intracellulaire de Pc1Δcoiled-coil montre un délai de maturation. Alors qu’in vitro le trafic Pc-1/Pc-2 dépend du motif coiled-coil pour leur interaction, in vivo une interaction Pc-1Δcoiled-coil/Pc-2 est détectée, suggérant un site d’interaction distinct. Nos études in vivo démontrent que le motif coiled-coil de Pc-1 joue un rôle clé dans sa maturation et l’existence d’un nouveau partenaire de Pc-1 pour son transport intracellulaire. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is the most prevalent genetic disorder that is characterize by the formation of bilateral renal cysts and leads to kidney failure. It results from mutations in the PKD1/polycystin-1(PC-1) gene, containing a coiled-coil motif, and in the PKD2/PC-2 gene, the functions of which remain to be elucidated. From a bacterial artificial chromosome, the murine Pkd1 gene (Pkd1-BAC) was modified in order to obtain 4 transgenic mouse lines deleted from it coiled-coil motif (Pkd1Δcoiled-coil) and 3 Pkd1TAG control lines possessing 1-35 copies of the transgene. These two transgenes have an expression profile identical to the endogenous gene and their expression depends on the number of copies. While Pkd1TAG mice develop ADPKD with a severity proportional to the level of expression, the Pkd1Δcoiled-coil lines are spared. These results demonstrate the importance of the coiled-coil motif in the disease. Pkd1Δcoiled-coil mice crossed by Pkd1-/- (lethal by birth), Pkd1-/-; Pkd1Δcoiled-coil survive after birth and allow the interactions, signaling and physiological role of the coiled-coil motif to be analyzed in vivo. These Pkd1-/-; Pkd1Δcoiled-coil mice with one copy of the transgene show kidney cysts and die ~ 2-weeks while high-copy ones have no phenotype as opposed to Pkd1-/-; Pkd1TAG who eventually develop cyst after 1 year. The genetic and biochemical results demonstrate that Pc-1Δcoiled-coil is hypomorphic. Although Pc-1Δcoiled-coil undergoes its autoproteolytic cleavage, analysis of the intracellular transport of Pc-1Δcoiled-coil shows a delay in maturation. While Pc-1 and Pc-2 appear to interact in vitro through their coiled-coil motif and co-transport, a Pc-1Δcoiled-coil -Pc-2 interaction is conserved in the kidney, suggesting a distinct mechanism of interactions in vivo. Thus, our results show that the coiled-coil motif of Pc-1 in vivo is involved in the maturation independently of Pc-2, highlighting the existence of a critical partner in intracellular transport.

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is one of the most common genetic diseases. ADPKD is manifested by the presence of renal cysts detected most often in the adult stage, and frequently liver cysts, with highly variable progression. ADPKD leads to kidney failure with the only recourse of dialysis and eventual kidney transplantation. Mutations dispersed throughout the PKD1 gene (major player, the polycystin-1 protein, PC1) and the PKD2 gene (polycystin-2 protein, PC2) are responsible for ADPKD. The loss of function (LOF) pathogenetic mechanism, and therefore a cellular recessive effect, has been suggested as causative of ADPKD. LOF is indeed supported by the PKD1/PKD2 gene inactivation mouse models, which develop cysts, although in utero with impressive speed in the kidney but not in the liver. Despite many in vitro studies, the membrane/ciliary role of PC1/PC2 remains rather hypothetical and context-dependent. These studies have associated PC1/PC2 to a variety of signaling pathways and underlined exceptional structural and functional complexity, whose involvement has been tested especially in LOF models. However, pathocellular observations in humans with sustained and even increased expression of PKD1/PC1, and the absence of particular human extrarenal phenotypes questions the exclusivity of the LOF mechanism. It was therefore essential 1) to clarify the pathogenetic mechanism, 2) to generate in vivo tools authentic of ADPKD in terms of initiation and progression of the disease and 3) to better understand the essential functions of PC1/PC2 for an adequate clinical translation. This thesis addresses all of these issues. First, we demonstrated that an increase in endogenous PKD1, just like in humans, is pathogenetic by generating and characterizing in detail a transgenic mouse model of Pkd1 (Pkd1TAG). This model not only reproduces the renal human characteristics associated with defects of the primary cilium, but also the extrarenal, namely, liver cysts. The severity of the phenotype correlates with the expression level of Pkd1, which strongly supports a dosage model. Secondly, we have demonstrated with genetic complementation studies that these two organs rely on a balance of Pc1 GPS cleavage, a typical post-translational modification of aGPCR, whose activity and abundance seem strictly controlled. Furthermore, we have extensively characterized Pc1 biogenesis and its derivatives in vivo generated upon GPS cleavage. We have identified a new form, predominantly on the membrane, the Pc1deN form, in addition to confirming the two N- and C-terminal Pc1 fragments (NTF and CTF, respectively), which associate non-covalently. Importantly, we have demonstrated that traffic of Pc1deN i.e., the NTF form detached from the CTF, is still dependant on the integrity of the CTF fragment. Next, we generated a first model humanizing a PKD1 nonsense truncated mutation at the level of the NTF(E3043X) domain by reproducing it in a transgenic mouse (Pkd1extra). Structurally, this mutation, which mimics Pc1deN, has also been shown to be causative of PKD. The Pkd1extra model allowed the proposition of the existence of a cross-interaction between different forms of Pc1. In addition, our two mouse models are both associated with altered levels of c-Myc and Pc2, which is supportive of their involvement in ADPKD and a functional interaction between the polycystins. Finally, we have shown a significant overlap between ADPKD and acute renal injury (ischemia/AKI) namely increased expression of Pc1 and Pc2 but also stimulation of several cystogenic factors such as tuberin, β-catenin and the oncogene c-Myc. Our studies have therefore given crucial evidence to the contribution of PKD1 gene dosage mechanism in ADPKD. We have developed two mouse models, which can serve as a tool for the analysis of human pathology as well as for preclinical validation of ADPKD. The identification of a new form of Pc1 adds an additional level of complexity in part explaining the regulation capacity of Pc1 on several signaling pathways. Our findings lead us to propose new therapeutic approaches: firstly, targeting the CTF i.e., chaperone style, and also targeting intracellular modulators (c-Myc, Pc2, Hif1α). Together, our work is of paramount importance in an informative point of view and practical perspective for progress towards a therapy for treating ADPKD. The sharing of common pathways between AKI and ADPKD paves the way for parallel therapeutic approaches for assured much faster treatment.