Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Ssu72, an RNA Pol II CTD phosphatase that is conserved across eukaryotes, has been reported to have a wide array of genetic and physical associations with transcription factors and complexes in RNA transcription. Catalytic mutants of Ssu72 are lethal across many eukaryotes, and mutations to non-catalytic sites in SSU72 phosphatase have been shown to lower function. One spontaneous mutation of the SSU72 gene in Saccharomyces cerevisiae (A to C nucleotide mutation resulting in an L84F mutation in the coded protein) was shown to have transcription termination deficiency (termination override or TOV). This SSU72 mutation was suggested by Loya et al. to cause a lowering of the phosphatase activity of the protein and consequently affect proper termination. In research reported herein, an investigation was completed through in-vitro and ex-vivo approaches with the goal of understanding the impact of the SSU72 TOV mutation on the observed phenotype in S. cerevisiae. It can be concluded from work presented in this report that the SSU72 TOV mutation does not cause a decrease in in-vitro phosphatase activity as compared to wild type. Evidence presented even suggests an increase in phosphatase activity as compared to wild type Ssu72. One model for the observed responses in transcription termination is that the phenylalanine substitution in Ssu72 leads to cooperative interactions with proline residues in the CTD. It is proposed that the corresponding increase in Ssu72 phosphatase activity limits RNA Pol II CTD association with termination factors, such as Nrd1, thus causing deficient transcription termination.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医科学) / 乙第13169号 / 論医科博第4号 / 新制||医科||6(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 萩原 正敏, 教授 近藤 玄, 教授 高田 穣 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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La synthèse d’ARN au cours de la différenciation des ovocytes est essentielle à la fécondation et à l'initiation du développement précoce. La nature de la machinerie basale de transcription pendant la croissance ovocytaire n'est pas connue mais la protéine TBP est remplacée par une protéine semblable spécifique des vertébrés, TBP2. Pour comprendre le rôle de TBP2 dans l'initiation de la transcription, nous avons effectué un RNA-seq à partir d'ovocytes contrôles et Tbp2-/- et montré que l'expression des gènes les plus transcrits ainsi celle des éléments rétroviraux endogènes de type MaLR est diminuée. Par immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse à partir d'ovaires, nous avons montré que TBP2 ne forme pas un complexe TFIID, mais est associé à TFIIA dans les ovocytes. Globalement nos données montrent qu’une machinerie d'initiation de la transcription spécifique différente du complexe canonique TFIID contrôle la transcription dans les ovocytes de souris. / Mammalian oocytes go through consecutive differentiation process, during which the synthesis and accumulation of RNAs are essential for oocyte growth, maturation, fertilization and early embryogenesis. Little is known about the nature and function of the oocyte Pol II transcription machinery. During oocyte growth TBP is replaced by a vertebrate specific paralog, TBP2, and Tbp2-/- females are sterile. To understand whether and how TBP2 is controlling transcription initiation during oogenesis, we carried out RNA-seq analyses from wild-type and Tbp2-/- oocytes from primary and secondary follicles. These analyses show a main decrease in the expression of the most abundant genes as well as specific down-regulation of the expression of the MaLR-type endogenous retroviral elements. To identify the nature of the complex associated with TBP2 in the oocytes, we carried out immunoprecipitation followed by mass spectrometry. We demonstrate that, in the oocytes, TBP2 associates with TFIIA, but does not assemble into a TFIID-type complex. Altogether, our data show that a specific TBP2-TFIIA-containing transcription machinery, different from canonical TFIID, drives transcription in mouse oocytes.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2009. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2008. / Härtill 4 uppsatser.

Chez les eucaryotes, la synthèse des ARN messagers (ARNm) est un processus hautement régulé en réponse à la fixation d’activateurs spécifiques sur des régions régulatrices. Cette étape permet le recrutement de co-activateurs, des facteurs généraux de la transcription (GTFs) et de l’ARN polymérase II (Pol II) pour former le complexe de préinitiation (PIC). Le Médiateur est un complexe co-activateur essentiel à ce processus et bien qu’il ait fait l’objet de nombreuses études ces dernières années, sa complexité a empêché de parvenir à une compréhension détaillée de son mécanisme de fonctionnement in vivo. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la sous-unité Med17 qui joue un rôle central au sein du module de tête du Médiateur et interagit directement avec la Pol II. Nous avons construit une collection de mutants thermosensibles de cette sous-unité chez la levure Saccharomyces cerevisiae, que nous avons ensuite caractérisés par différentes approches de biologie moléculaire et génomique fonctionnelle. Nos analyses par ChIP-seq montrent que le Médiateur influence indépendamment le recrutement et/ou la stabilisation de la TBP ainsi que des modules cœur et kinase de TFIIH sur le génome. Ces résultats indiquent que, contrairement à la séquence d’assemblage linéaire observée in vitro, l’assemblage du PIC in vivo est un processus à plusieurs étapes non-séquentielles et que le Médiateur est important pour orchestrer l’arrivée des différents composants du PIC. Par ailleurs, nous avons mis en évidence un contact direct entre le Médiateur et Rad2/XPG, une endonucléase qui intervient dans la réparation de l’ADN. Une analyse à l’échelle du génome a révélé que cette protéine est présente sur les gènes de classe II, en absence de stress génotoxique et que sa localisation génomique corrèle avec celle du Médiateur. Nous avons ainsi démontré que le Médiateur est important pour le recrutement de Rad2, suggérant un nouveau rôle pour ce complexe dans la réparation de l’ADN, en plus de son rôle de co-activateur dans la transcription par la Pol II. / In eukaryotes, the synthesis of messenger RNA (mRNA) is highly regulated in response to the binding of specific activators to regulatory regions. This step allows the recruitment of coactivators, general transcription factors (GTFs) and RNA polymerase II (Pol II) to form the preinitiation complex (PIC). Mediator is a co-activator complex essential to this process and although it has been studied intensively during the last few years, its complexity has precluded a detailed understanding of the molecular mechanisms of its function in vivo. During my PhD, I focused on the Med17 subunit which plays a central role within the Mediator head module and interacts directly with Pol II. We obtained a large collection of temperature-sensitive mutants of this subunit in the yeast Saccharomyces cerevisiae, and then characterized these mutants by different molecular biology and functional genomics approaches. Our ChIP-seq analyses show that Mediator influences independently the recruitment and/or the stabilization of TBP as well as TFIIH core and kinase modules on the genome. These results indicate that, unlike a linear sequence observed in vitro, in vivo the PIC assembly is a non-sequential multistep process and that Mediator is important to orchestrate the recruitment of different PIC components. Furthermore, we identified a direct contact between Mediator and Rad2/XPG, an endonuclease involved in DNA repair. A genome-wide analysis reveals that this protein is present on class II genes in the absence of genotoxic stress, and that its genomic localization correlates with that of Mediator. We thus demonstrated that Mediator is important for Rad2 recruitment, suggesting a new role for this complex in DNA repair, in addition to its co-activator role in Pol II transcription.

Abstract: Molecular and cellular insights into IKAP and Elongator functions As the first step in the complex process of gene expression, the transcription of genes from DNA to RNA by RNA polymerase II is subject to a multiplicity of controls and is thereby the endpoint of multiple cell regulatory pathways. We focused here on the molecular and cellular functions of IKAP and by extension of Elongator complex, initially found associated with the hyperphosphorylated RNA polymerase II during the elongation stage of transcription. IKAP is required for the assembly of Elongator subunits into a functional complex. Elongator has a histone acetyltransferase (HAT) activity associated with one of its subunits, named hELP3. In agreement with a potential role in transcript elongation, Elongator is associated with nascent RNA emanating from the elongating RNA polymerase II along the transcribed region of several yeast genes and chromatin immunoprecipitation experiments have also demonstrated an association of Elongator with genes in human cells. Different mutations in the human IKBKAP gene, encoding IKAP/hELP1, cause familial dysautonomia, a severe neurodevelopmental disease with complex clinical characteristics. Affected individuals are born with the disease and abnormally low numbers of neurons in peripheral nervous ganglions. To gain insight into the role played by IKAP and the Elongator complex in the transcription of genes and concomitantly learn about the molecular defects underlying the FD, an RNA interference approach was used to deplete the IKAP protein in human cells. In yeast, disruption of ELP1 (yeast homolog of human IKAP) is known to destabilize the ELP3 catalytic subunit, which leads to loss of Elongator integrity. Our experiments performed in human cells revealed that the levels of hELP3 protein is also affected by IKAP depletion after RNAi. We took advantage of this cellular loss-of-function model to identify genes whose transcription requires IKAP, by microarray experiments. Among the identified candidates, several were previously described to be involved in cell motility, or actin cytoskeleton remodelling. Because cell motility is of crucial importance for the developing nervous system, and therefore of obvious relevance to FD, the potential role of IKAP in cell motility was characterized at the cellular level. Several cell motility/migration assays demonstrated that the IKAP depletion has functional consequences so that IKAP-depleted cells showed defects in migration. Particularly, the reduced cell motility of neuronal-derived cell lines may be highly relevant to the neurodevelopmental disorder that affects FD patients. Whether or not the defects in cell migration resulted of impaired transcriptional elongation of the IKAP-dependent genes was investigated by chromatin immuno-precipitation technique. These experiments indicated that IKAP depletion leads to a decreased histone H3 acetylation in the transcribed region of its target genes in the context of Elongator complex. These acetylation defects are correlated with a decrease of the RNA polymerase II recruitment through the transcribed region of target genes, whereas the recruitment on the promoter is mostly unaffected. These results indicate that Elongator affects transcript elongation in vivo, but not the recruitment of the RNA polymerase II to the promoter. These very specific effects of IKAP/hELP1 depletion on histone acetylation and RNA polymerase II density across target genes are consistent with a direct effect of Elongator on transcriptional elongation in vivo and point to a function for Elongator in histone acetylation during transcript elongation. Résumé: Caractérisation des rôles biologiques de la protéine IKAP et du complexe Elongator La transcription des gènes de lADN en ARN est fondamentale pour lexpression des protéines et la capacité de nos cellules à sadapter à leur environnement. Ce processus finement régulé est catalysé par un enzyme, lARN polymérase II, vers lequel convergent une multitude de voies de signalisation. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux fonctions moléculaires et cellulaires de la protéine IKAP et du complexe Elongator. IKAP est la protéine qui assemble les sous unités dElongator en un complexe fonctionnel. Le complexe Elongator est associé à lARN polymérase II hyper-phosphorylée pendant létape délongation de la transcription et possède une activité histone acétyltransferase associée à une de ses sous unités, appelée ELP3. Chez la levure, Elongator est recruté an niveau des ARNs naissants, qui émanent directement de lARN polymérase II au niveau de la région transcrite des gènes étudiés. De plus, des expériences dimmunoprécipitation de la chromatine ont mis en évidence la présence du complexe Elongator au niveau de plusieurs gènes humains. Différentes mutations au niveau du gène IKBKAP, codant pour la protéine IKAP, sont responsables de la dysautonomie familiale, une maladie génétique qui affecte le développement du système nerveux périphérique. En effet, les individus affectés présentent une diminution de la densité de neurones au niveau des ganglions nerveux périphériques. Lobjectif de nos travaux est de comprendre davantage le rôle de la protéine IKAP et du complexe Elongator dans la transcription des gènes et ainsi, dinvestiguer les mécanismes moléculaires responsables dans la physiopathologie de la dysautonomie familiale. Un modèle de perte de fonction pour la protéine IKAP a dabord été généré par interférence dARN. Des travaux réalisés chez la levure indiquent que la protéine ELP1 (homologue de IKAP chez la levure) est essentielle pour la stabilité de la sous unité catalytique du complexe, la protéine ELP3. Les expériences réalisées sur notre modèle humain démontrent que le taux de la protéine ELP3 est également affecté par la déplétion dIKAP causée par linterférence dARN. Ce modèle de perte de fonction a été utilisé afin détablir la liste des gènes dont lexpression est contrôlée par la protéine IKAP, par des expériences de microarrays. Parmi les candidats identifiés, plusieurs ont été décrits comme impliqués dans la migration cellulaire et le remodelage du cytosquelette dactine. Le processus de migration des cellules est fondamental au cours du développement du système nerveux et par conséquent particulièrement relevant dans le contexte de la dysautonomie familiale. Limplication dIKAP dans la migration cellulaire a été investigué par différents tests de fonction qui montrent que la diminution dIKAP dans différentes lignées cellulaires entraîne une réduction significative de leur capacité migratoire. Ces résultats suggèrent que la diminution du nombre de neurones observée dans les ganglions périphériques des patients atteints de la dysautonomie familiale pourrait résulter dune altération de leur capacité à migrer au cours du développement. Enfin, des expériences dimmunoprécipitation de la chromatine ont été menées en utilisant notre modèle afin de déterminer dans quelle mesure le déficit de migration observé en labsence dIKAP serait la conséquence dun défaut de la fonction dElongator au niveau de lélongation de la transcription des gènes. Les résultats nous ont montré que la diminution dexpression dIKAP entraîne une réduction de lacétylation des histones H3 dans la région transcrite de ses gènes cibles. De plus, ce déficit dacétylation est directement corrélé avec un désengagement progressif de lARN polymérase II le long de la région transcrite de ces gènes. Par conséquent, ces résultats démontrent que le complexe Elongator affecte lélongation des transcrits in vivo, mais pas le recrutement de lARN polymérase II au niveau du promoteur. Ces effets très spécifiques de labsence dIKAP sur lacétylation des histones et lengagement de la polymérase II dans la transcription des gènes cibles montrent quElongator exerce un rôle direct au niveau de lélongation de la transcription de ces gènes. De plus, ces résultats suggèrent que la fonction dElongator serait dacétyler les histones au cours de lélongation transcriptionnelle in vivo.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.

Afin de caractériser les profils de distribution de l’ARN Pol II en aval des EAGs, j’ai réalisé des expériences de ChIP-seq en utilisant un anticorps reconnaissant toutes les formes d’ARN Pol II humaine. J’ai analysé les profils de Pol II en aval de 13787 gènes qui n’ont pas de gène flanquant à +/- 4kb en amont ou en aval. Nos résultats ont été analysés en comparaison avec des données disponibles de séquençage à haut débit d’ARN naissants (Global Run On assay coupled sequencing : GRO-seq). Nos résultats montrent qu’un enrichissement de la Pol II en aval de l’extrémité des unités de transcription est une caractéristique partagée par tous les gènes exprimés et reflète la présence d’ARN Pol II active. Des analyses bioinformatiques (K-means clustering) m’ont permis de distinguer quatre groupes de gènes : le premier groupe (H) est caractérisé par un profil de pause étroit alors que les trois autres groupes (PA1-PA3) montrent un profil large ou très large, pouvant aller jusqu’à 6kb en aval des EAGs. Des analyses d’annotations (Gene Ontology) révèlent que le groupe H contient pratiquement exclusivement des gènes d’histones qui ne contiennent pas d’intron et dont les transcrits ne sont pas polyadénylés. A l’inverse, les groupes PA1-PA3 contiennent des gènes codant pour des transcrits polyadénylés. J’ai confirmé par des expériences de ChIP couplées à une analyse par qPCR les différents types de profils de distribution de Pol II décrits par analyse bioinformatique. Nos résultats sont en accord avec d’autres publications et suggèrent un lien entre le profil de distribution de la Pol II à l’extrémité 3’ des gènes histones et les mécanismes particuliers de maturation de l’extrémité 3’ de ces transcrits. Cette idée est renforcée par nos analyses fonctionnelles montrant que l’inhibition des mécanismes de polyadénylation augment la présence de l’ARN Pol II en 3’ des EAGs pour les gènes codant pour des transcrits polyadénylés. / The Pol II transcription cycle can be divided into three main phases: transcription initiation, elongation and termination. Each phase represent a possibility for the regulation of gene expression. Recently, genome-wide studies demonstrated that Pol II pausing is an important regulatory step that is present at almost every eukaryotic Pol II promoter. Surprisingly, paused or slowed down polymerases were also discovered downstream of 3’ end of genes, of which the exact role is still not fully understood.During my Ph.D. I carried out projects using chromatin immunoprecipitation assay coupled to high-throughput sequencing techniques to analyze genome-wide Pol II behavior in two aspects:First, we analyzed Pol II occupancy downstream of 3’ end of transcription units. Our analyses suggest that accumulation of Pol II downstream of genes is a genome-wide feature of active transcription. We found broad, often up to 6kb long Pol II occupancy signals at genes coding for polyadenylated transcripts. In contrast, Pol II occupancy shows a narrow profile at the annotated end of core histone genes. We also found a link between RNA 3’ end processing and Pol II accumulation at the end of transcription units.Second, we were following the genome-wide response and alteration of Pol II transcription upon genotoxic stress. Following UV-B treatment we observed a progressive Pol II signal loss from the promoters of expressed genes, which will then extend through the entire transcription unit, up to four hours after irradiation. This is in good agreement with the observation that after UV irradiation transcription is arrested during the period of transcription-coupled repair (TCR).