TAF6 est un co-facteur de transcription qui fait partie du complexe multiprotéique, TFIID. TAF6 possède 4 isoformes et deux d'entre eux ont des fonctions opposées. TAF6[alpha] est l'isoforme anti-apoptotique et peut dimériser avec TAF9, tandis que TAF6[delta] est l'isoforme pro-apoptotique et ne peut pas dimériser avec TAF9. TAF6[delta] induit l'apoptose indépendamment de p53. Cette nouvelle voie apoptotique présente un intérêt certain et l'étude de la régulation de l'épissage alternatif de TAF6[delta] est essentielle pour comprendre le mécanisme par lequel TAF6[delta] induit l'apoptose. Nous avons donc développé un minigène de TAF6 qui récapitule le patron d'épissage endogène. Nous avons muté le minigène TAF6 afin d'identifier des éléments sur l'ARN controllants son épissage. Ces éléments ont été retrouvés surtout au niveau de l'exon 2 et de l'intron entre l'exon 2 et l'exon 3. Trois sites activateurs d'épissage ont été déterminés dans l'exon 2. De plus, nous avons démontré la présence d'une structure secondaire importante dans le choix du site 5' d'épissage. Nous avons aussi établi que la distance de 30 nucléotides entre les deux sites 5' d'épissage avait un rôle à jouer dans le choix de ce site d'épissage. Un dernier site activateur a été positionné dans l'intron. D'après ces résultats de mutations et un criblage PCR d'ADNc de cellules transfectées par des siRNAs contre des protéines de liaison à l'ARN, nous avons identifié hnRNP K comme facteur trans potentiel régulant l'épissage de TAF6. Les facteurs trans liants les éléments cis permettent de réguler en partie l'épissage alternatif d'un ARN pré-messager. Des expériences d'immunoprécipitation in vivo nous ont permis d'établir qu'il existe une interaction entre l'ARN de TAF6 et hnRNP K. Le signal extracellulaire qui agit sur les éléments cis et permet de changer l'épissage alternatif de TAF6 est encore inconnu. Nous avons tenté de le déterminer, mais, pour l'instant, nos hypothèses n'ont pas été confirmées par les expériences menées. L'apoptose, si elle est dérégulée, peut mener à des pathologies. L'expression de TAF6 et l'inclusion d'éléments répétitifs Alus dans son ARN messager ont été démontrés comme étant augmentées dans les cellules tumorales du sein. Nous avons aussi commencé l'étude de l'importance de ces éléments répétitifs dans l'augmentation de l'expression de TAF6 dans les cancers. Nous avons identifié une mutation ponctuelle au niveau de la deuxième séquence répétitive Alu qui peut être retrouvée dans TAF6, mais nous ne connaissons pas encore sa fonction dans la surexpression de TAF6 dans les cancers du sein. Bref, ce mémoire présente les différents résultats obtenus dans le cadre d'expériences dont le but était d'identifier les éléments cis, les facteurs trans, le signal déclenchant l'épissage et le rôle des éléments répétitifs Alus présents dans l'ARN de TAF6.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

TATA-Binding Protein Associated Factors 5, 12, and 13 (TAF5, 12, 13) are components of the transcription preinitiation complex (PIC). The transcription PIC is essential for initiation of the transcription at the majority of loci. The transcription PIC is made up of the RNA polymerase II (RNApII) and six general transcription factors TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, and TFIIH. The general transcription factor TFIID is made up of TATA-Binding Protein (TBP) and 13 highly conserved TBP-Associated Factors (TAFs). Some TAFs (TAF5, TAF6, TAF9, TAF10, TAF12) are also members of another complex involved in transcription, SAGA (Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase). We have undertaken a systemic characterization of Taf5, Taf12, and Taf13 homozygous mutants to determine the developmental and molecular phenotype in embryos lacking functional Taf5, Taf12, and Taf13. Breeding heterozygous mice of each Taf knockout does not yield Taf5, Taf12, and Taf13 homozygous null pups, indicating that the homozygous embryos are dying in utero. Our studies reveal that Taf5, Taf12 homozygous null embryos share an earlier lethal phenotype than Taf13 homozygous null embryos, suggesting different roles of Tafs that are members of SAGA in addition to TFIID. Taf5 and Taf12 homozygous null embryos fail to implant and are not recovered at day 7.5 of embryonic development (E7.5) whereas Taf13 homozygous null embryos do reach egg-cylinder stage but are developmentally delayed compared to their littermates at E7.5 and fail to initiate gastrulation. We also show transcriptome similarities and differences across Taf5, Taf12 and Taf13 homozygous null embryos by RNA-seq analysis to better understand if these Tafs are involved in two regulatory complexes versus one.

La transcription des gènes humains par la polymérase II (Pol II) commence avec l'assemblage du complexe de pré-initiation (PIC) au niveau du promoteur. L'assemblage du PIC est initié par le facteur de transcription général TFIID, un complexe de protéines faisant 1 mégadalton et contenant TBP et 13 facteurs TBP-associés (TAF). Des études structurales sur TFIID par cryo-EM ont révélé l'architecture globale de TFIID, donnant un aperçu de l'assemblage des sous-unités et la reconnaissance du promoteur à faible et moyenne résolution. Cependant, les structures à haute résolution de plusieurs TAF ne sont pas disponibles à ce jour, ce qui limite notre compréhension actuelle des interactions TAF-TAF et du mécanisme d'assemblage de TFIID.J'ai utilisé une stratégie de co-expression dans des cellules d'insectes sur la base de notre système MultiBac afin d'obtenir des sous-complexes recombinants TFIID de qualité sans précédent et de quantité suffisante pour des études structurales. J'ai cristallisé un complexe contenant les TAFs TAF5, TAF6 et TAF9 et déterminé sa structure à une résolution de 2.7 Å. Notre structure donne des aperçus détaillés sur les interactions de ces sous-unités essentiels de TFIID: La structure révèle des interactions serrés inattendues entre le domaine N-terminal et le domaine à répétition WD40 contenant 7 lames de TAF5 avec le domaines "histone fold" (HFDs) de TAF6/9. Les interactions entre ces domaines conservés inter-espèces expliquent en détail comment TAF5 sert de plate-forme de liaison pour les HFDs dans TFIID. Cette étude étend notre compréhension de l'échafaudage moléculaire au noyau central de la version humaine de TFIID, ce qui est essentiel pour la formation de holo-TFIID.De plus, j'ai pu isoler un domaine structural conservé de la version humaine de TAF6, le domaine à répétition HEAT de TAF6 en utilisant une approche de protéolyse limitée sur des core-complexes TAF5/6/9 prédéfinis. J'ai pu déterminer la structure du domaine à répétition HEAT de TAF6 jusqu'à 2,0 Å de résolution. La structure offre un éclairage supplémentaire sur l'architecture de la version humaine de TFIID et révèle la présence d'une grande zone chargée positivement sur sa surface, probablement impliqué dans la liaison à l'ADN du noyau promoteur liaison.Basé sur les structures résolues et les informations obtenues dans des expériences de protéolyse limitée, j'ai pu identifier les complexes minimaux de la base du complexe TFIID humain (TAF 4/5/6/9/12). J'ai identifié les HFDs de l'hétérodimère TAF4/12 comme étant essentielle à la formation d'un complexe avec TAF5/6/9. Ces résultats guideront la conception future de construction pour la cristallisation du complexe humain TFIID de base, améliorant ainsi nos connaissances sur le mécanisme d'assemblage de TFIID ainsi que sur l'architecture de ses principaux composants à une résolution atomique. / Human gene transcription by Polymerase II (PolII) begins with the assembly of the pre-initiation complex (PIC) at the promoter. PIC assembly is initiated by the general transcription factor TFIID, a megadalton sized protein complex containing TBP and 13 TBP associated Factors (TAFs).
Structural studies on TFIID by cryo-EM have revealed the overall architecture of TFIID, providing insights into subunit assembly and promoter recognition at low to medium resolution. However, high-resolution structures of several TAFs are not available to date, limiting our current understanding of TAF-TAF interactions and the assembly mechanism of TFIID.I used a co-expression strategy in insect cells based on our MultiBac system to obtain recombinant TFIID sub-complexes of unprecedented quality and quantity for structural studies. I crystallized a complex containing the TAFs TAF5, TAF6 and TAF9 and determined its structure up to a resolution of 2.7 Å. Our structure gives detailed insights into the interactions of these essential TFIID subunits: The structure reveals unexpected tight interactions between the N-terminal domain and the 7-bladed WD40 repeat domain of TAF5 with the TAF6/9 histone fold domains (HFDs). The interactions between these inter-species conserved domains explain in detail how TAF5 serves as a binding platform for HFDs in TFIID. This study extends our understanding of the molecular scaffold at the central core of human TFIID, which is essential for holo-TFIID formation.Additionally, I could isolate a conserved structural domain of human TAF6, the TAF6 HEAT repeat domain by using a limited proteolysis approach on predefined TAF5/6/9 core-complexes. I could determine the structure of the TAF6 HEAT repeat domain up to 2.0 Å resolution. The structure provides additional insights into the architecture of human TFIID and reveals the presence of a large positively charged patch on its surface, probably involved in core-promoter DNA binding.Based on the obtained structures and information gained in limited proteolysis experiments, I was able to identify minimal complexes of human core-TFIID (TAFs 4/5/6/9/12). I identified the HFDs of the TAF4/12 heterodimer to be essential for the complex formation with TAF5/6/9. These findings will guide future construct design for crystallization of human core-TFIID, enhancing our knowledge about the TFIID assembly mechanism and the architecture of its core-components at atomic resolution.

TFIID et SAGA sont deux complexes importants pour la transcription, contenant la sous-unité TAF10. Nous avons analysé leur composition dans l’embryon murin et différents contextes cellulaires par immuno-précipitation et spectrométrie de masse. Les sous unités des complexes TFIID et SAGA ont été détectées en proportion différente selon le type cellulaire. Par filtration sur gel, des sous-complexes de TFIID ont aussi été détectés. En absence de TAF10, l’assemblage de TFIID et SAGA est fortement affecté mais la formation des somites n’est pas initialement affecté ni l’expression globale des gènes. L’analyse des niveaux d’ARN totaux et naissants dans les cellules ES murines suggèrent que TFIID et SAGA sont requis globalement pour l’initiation de la transcription, mais que la diminution de la synthèse des ARNm est compensée. / TFIID and SAGA are two multi-subunit complexes which play important roles in transcription and that contain the TAF10 subunit. By immunoprecipitation followed by mass spectrometry, we analyzed the composition of TFIID and SAGA complexes in the embryo as well as in different cellular contexts. TFIID and SAGA complexes subunits were detected in different proportions depending on the cellular context. By gel filtration, we also detected distinct TFIID sub-complexes. In the absence of TAF10, TFIID and SAGA assembly is severely impaired but neither early somitogenesis nor global gene expression is affected. Steady-state and newly transcribed mRNA analyses in mES cells suggest that TFIID and SAGA are generally required for transcription initiation. However, the decrease of mRNA synthesis is compensated.

La synthèse d’ARN au cours de la différenciation des ovocytes est essentielle à la fécondation et à l'initiation du développement précoce. La nature de la machinerie basale de transcription pendant la croissance ovocytaire n'est pas connue mais la protéine TBP est remplacée par une protéine semblable spécifique des vertébrés, TBP2. Pour comprendre le rôle de TBP2 dans l'initiation de la transcription, nous avons effectué un RNA-seq à partir d'ovocytes contrôles et Tbp2-/- et montré que l'expression des gènes les plus transcrits ainsi celle des éléments rétroviraux endogènes de type MaLR est diminuée. Par immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse à partir d'ovaires, nous avons montré que TBP2 ne forme pas un complexe TFIID, mais est associé à TFIIA dans les ovocytes. Globalement nos données montrent qu’une machinerie d'initiation de la transcription spécifique différente du complexe canonique TFIID contrôle la transcription dans les ovocytes de souris. / Mammalian oocytes go through consecutive differentiation process, during which the synthesis and accumulation of RNAs are essential for oocyte growth, maturation, fertilization and early embryogenesis. Little is known about the nature and function of the oocyte Pol II transcription machinery. During oocyte growth TBP is replaced by a vertebrate specific paralog, TBP2, and Tbp2-/- females are sterile. To understand whether and how TBP2 is controlling transcription initiation during oogenesis, we carried out RNA-seq analyses from wild-type and Tbp2-/- oocytes from primary and secondary follicles. These analyses show a main decrease in the expression of the most abundant genes as well as specific down-regulation of the expression of the MaLR-type endogenous retroviral elements. To identify the nature of the complex associated with TBP2 in the oocytes, we carried out immunoprecipitation followed by mass spectrometry. We demonstrate that, in the oocytes, TBP2 associates with TFIIA, but does not assemble into a TFIID-type complex. Altogether, our data show that a specific TBP2-TFIIA-containing transcription machinery, different from canonical TFIID, drives transcription in mouse oocytes.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Des études antérieures suggèrent que les complexes SAGA et TFIID sont des facteurs jouant un rôle complémentaire dans la transcription par l’ARN polymérase II. Chez S. cerevisiae, environ 10% des gènes semblent dépendants de SAGA alors que TFIID aurait un rôle dominant sur 90% du génome. De nouvelles approches m’ont permis de montrer que SAGA est recruté sur les régions régulatrices d’une majorité de gènes, indépendamment de leur classification. Des analyses d’ARN nouvellement-synthétisés ont également démontré que l’inactivation des complexes SAGA ou TFIID, par mutation ou déplétion inductible de leurs sous-unités, altèrent la transcription de pratiquement tous les gènes par l’ARN polymérase II. L’acétyltransférase Gcn5 et la sous-unité Spt3 agissent de façon synergique au sein du complexe SAGA pour stimuler le recrutement de TBP et la transcription par l’ARN polymérase II. Ces données indiquent que les complexes SAGA et TFIID agissent comme des cofacteurs généraux, étant nécessaires pour la synthèse de quasiment tous les ARNm et ayant des effets équivalents sur les gènes précédemment décrits comme dominés par SAGA ou par TFIID. / Prior studies suggested that SAGA and TFIID are alternative factors that promote RNA polymerase II (RNA Pol II) transcription with about 10% of genes in S. cerevisiae dependent on SAGA. The remainder 90% of the genome would be regulated by TFIID. We reassessed the role of SAGA by mapping its genome-wide location and role in global transcription in budding yeast. We observed that SAGA maps to regulatory elements of most genes, irrespective of previous designations of SAGA- or TFIID-dominated genes. Additionally, disruption of either SAGA or TFIID through mutation or rapid subunit depletion reduces transcription from nearly all genes, measured by newly-synthesized RNA or RNA Pol II chromatin immunoprecipitation. We also found that the acetyltransferase Gcn5 synergizes with Spt3 to promote global transcription and that Spt3 functions to stimulate TBP recruitment at all tested genes. Our data demonstrate that both SAGA and TFIID act as general cofactors required for essentially all RNA Pol II transcription and is not consistent with the previous classification of SAGA- and TFIID-dominated genes.

Les complexes multi-protéiques jouent un rôle crucial dans les cellules vivantes en catalysant et servant d'intermédiaires entre pratiquement toutes les activités cellulaires essentielles. Cependant, un grand nombre de ces machines se trouvent en très faibles quantités dans les cellules en particulier en ce qui concernent les complexes eucaryotes. Ceci est réfractaire à leur extraction à grande échelle et empêche sévèrement l'élucidation de leur structure et fonction. Dans le but de rendre les complexes multi protéiques accessibles par la voie de production recombinante, le groupe Berger a mis au point un ensemble de systèmes d'expression sur mesure pour la surproduction de complexes multi protéiques dans différents organismes hôtes incluant E. coli, les cellules d'insectes et les cellules de mammifères. Ces systèmes et en particulier le système MultiBac baculovirus/cellules d'insecte ont d'ors et déjà grandement contribués à l'étude de l'assemblage structural et fonctionnel à l'échelle moléculaire et atomique de nombreux complexes multi protéiques importants. Cela inclut en particulier le facteur général humain de transcription TFIID, un complexe de ~1.5 MDa qui constitue le sujet de recherche du laboratoire Berger. Mes contributions dans le développement de la technologie pour la production et dans l'élucidation des complexes TFIID humains sont discutées en détails dans cette thèse. / Multiprotein complexes play a crucial role in living cells by catalyzing and mediating virtually all essential cellular activities. However, many of these essential machines exist in very low endogenous amount in cells, in particular for eukaryotic complexes. This is refractory to large-scale extraction from native source material, severely impeding the elucidation of their structure and function. In order to make multiprotein complexes accessible by means of recombinant production, the Berger laboratory has developed an array of advanced expression systems tailor-made for overproducing multiprotein complexes in various host organisms including E. coli, insect cells and mammalian cells. Those systems, in particular the MultiBac baculovirus/insect cell system have already greatly contributed to studying the structural and functional assemblies of numerous important multiprotein complexes in molecular and atomic detail. Notably, this includes also the human general transcription factor TFIID, a ~1.5 MDa complex, which is the research focus of the Berger laboratory. My contributions to the expression technology development and to the structural elucidation of human TFIID complexes are discussed in details in this thesis.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 69-77).