La découverte récente du premier gène de résistance plasmidique à la colistine mcr-1 a mis en évidence le besoin urgent d'améliorer la détection des isolats résistant à la colistine dans les laboratoires de microbiologie clinique afin de pouvoir rapidement isoler les patients porteurs. L’objectif de ma thèse a ainsi été de répondre à cette problématique par le développement et l’évaluation d’outils spécifiques. Une revue a été rédigée visant à résumer les nouveaux outils développés pour détecter la résistance aux polymyxines, y compris la présentation des méthodes actuelles phénotypiques, antibiogrammes et génotypiques. Le milieu de culture LBJMR a été développé pour détecter toutes les bactéries à Gram négatif résistantes à la colistine et également les souches d’entérocoques résistants à la vancomycine qui représentent un autre problème majeur de santé publique. LBJMR est polyvalent et a permis de dépister 3 bactéries d'intérêt clinique à partir d’un même échantillon: E. coli et K. pneumoniae résistantes à la colistine, et E. faecium résistant à la vancomycine. Un brevet a été déposé. Le kit UMIC Colistine est un dispositif commercial de détermination de la CMI basé sur la méthode de référence. Évalué conformément à la norme ISO 20776, sa sensibilité était excellente pour la détection des souches porteuses du gène mcr-1. Le kit UMIC Colistine constitue ainsi une méthode rapide et fiable pour évaluer la CMI des isolats cliniques dans les laboratoires de microbiologie clinique. Enfin, mes travaux de thèse ont compris l’analyse d’une souche de K. pneumoniae hétérorésistante à la colistine et la description d’une nouvelle espèce bactérienne : Pseudomonas massiliensis. / The recent discovery of mcr-1, the first plasmid-mediated colistin resistance gene, highlighted the urgent need to implement the detection of colistin-resistant isolates in clinical microbiology laboratories, in order to isolate carrier patients. My thesis aimed to address this issue by developing and evaluating specific tools. A review was redacted to summarize the new tools developed to detect polymyxin resistance including the current phenotyping, susceptibility testing and genotyping methods. The LBJMR culture medium has been developed to detect all colistin-resistant Gram-negative bacteria and also the vancomycin-resistant enterococci which represent another major problem of public health. The LBJMR medium allowed the detection of different bacteria of interest from the same clinical sample: colistin-resistant E. coli and K. pneumoniae and also a vancomycin-resistant E. faecium. This project led to a patent filing. The UMIC Colistine kit is a ready-to-use device based on the reference method to determine the polymyxin MIC. Evaluated in accordance with ISO 20776 standard, its sensitivity was excellent for the detection of colistin-resistant strains harboring the mcr-1 gene. The UMIC Colistin system is a rapid and reliable method to determine colistin MIC of clinical isolates in clinical microbiology laboratories. My thesis project also included the analysis of a colistin-heteroresistant Klebsiella pneumoniae strain, and the description of a new bacteril species, Pseudomonas massiliensis. These studies highlight the need to improve the detection of colistin-resistant strains by using reliable methods, suitable for diagnosis in clinical microbiology laboratories.

La résistance aux polymyxines chez P. aeruginosa résulte en partie de la modification du lipide A par addition de 4-amino-aL-arabinose (L-Ara4N), due à l'expression de l'opéron arnBCADTEF-ugD (arn), activée par au moins 6 systèmes de régulation à deux composants (S2C). Nous avons mis en évidence que P. aeruginosa était capable de s'adapter de manière transitoire à la présence de fortes concentrations de polymyxines (8 x CMI) aussi bien in vitro que in vivo dans un modèle murin d'infection pulmonaire aiguë. La délétion de l'opéron arn chez la souche sauvage n'a pas modifié la capacité d'adaptation de P. aeruginosa. Afin d'identifier les gènes impliqués dans le processus adaptatif, le transcriptome global du mutant PAOl/z«;-Aar«-ATCS délété des principaux S2C (parRS, pmrAB, cprRS eiphoPQ) et de l'opéron arn a été réalisé en présence de différentes concentrations de colistine par RNA-Seq. Deux nouveaux mécanismes ont ainsi été identifiés. L'un repose sur l'expression de l'opéron mmsAB codant des enzymes du catabolisme des acides gras et l'autre fait intervenir le facteur sigma alternatif AlgU. Seule la délétion conjointe du gène algW participant à l'activation de AlgU et des opérons arn, mmsAB, pmrAB, parRS, phoPQ et cprRS a permis d'abolir complètement la résistance adaptative à la colistine. Par ailleurs, nous avons mis en évidence le rôle des vésicules de membrane externe (OMVs) dans la séquestration de l'antibiotique, dont la production semble régulée au moins par AlgU et le PQS. Ces travaux offrent des perspectives intéressantes pour l'identification de nouvelles cibles antibactériennes et pour l'amélioration de l'effet bactéricide des polymyxines. / Resistance to polymyxins in Pseudomonas aeruginosa involves the addition of 4-amino-L-arabinose (Ara4N) to LPS phosphates, thanks to an enzymatic modification due to the operon named arnBCADTEF-ugD (arn) whose expression is activated by at least 6 two component regulatory Systems (TCS). We demonstrated that P. aeruginosa was able to resist in a transient way to high concentrations of polymyxins (8x MIC) in vitro and in vivo in a mice lung infection model. Arn operon deletion in the wild type strain did not modify the ability to adapt to polymyxins. In order to identify gènes involved in adaptive resistance, we performed RNA-seq transcriptomes of quintuple mutant PAO\lux-Aaw-ATCS exposed to different concentrations of colistin or non exposed. Two new mechanisms were identified. The first one is based upon mmsAB operon encoding fatty acid catabolism enzymes and the second one is due to the sigma factor AlgU. Only the deletions of algW%enz involved in AlgU activation and arn, mmsAB, pmrAB, parRS, phoPQ and cprRS operons completely abolished the adaptive process. We also demonstrated the role of outer membrane vesicles in the sequestration of colistin whose production is regulated by AlgU and PQS. This study provides knoweldge essential for the design of novel strategies aimed at tackling the adaptive resistance to polymyxins.