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Caractérisation et étude de l'effet des sources de carbone et d'azote sur la production de nouveaux métabolites secondaires chez Aspergillus ochraceus non producteur de l'ochratoxine AAwad, Gamal Lebrihi, Ahmed. January 2008 (has links)
Reproduction de : Thèse de doctorat : Génie des procédés : Toulouse, INPT : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 330 réf.
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Caractérisation des beta-lactamases et leur inhibition par les extraits de plantes médicinales/beta-lactamase characterization and their inhibition by medicinal plants extractGangoué Pieboji, Joseph 09 November 2007 (has links)
Les bactéries productrices de β-lactamase à spectre élargi (BLSE) ont été rapportées dans plusieurs pays, mais aucune information nest disponible sur les différents types de BLSE produits par les Entérobactéries au Cameroun. On distingue plus de 290 types de β-lactamases divisés en 4 classes (A, B, C, et D) et jusquaujourdhui il nexiste pas des inhibiteurs capables dinhibés toutes les classes de β-lactamase.
Un total de 267 souches dEntérobactéries a été isolé entre 1995-1998 (259 souches) et 2002 (8 souches) des produits pathologiques (urines, pus et sang) des patients hospitalisés dans divers services de lHôpital Central de Yaoundé. Létude de la sensibilité in vitro de ces bactéries à 12 antibiotiques (amoxicilline, amoxicilline/acide clavulanique, pipéracilline, imipénème, céfazoline, céfoxitine, céfotaxime, ceftazidime, aztréonam, gentamicine, ofloxacine et triméthoprime/sulfaméthoxazole) par la méthode des disques a permis de noter un certains nombre de faits : limipénème, lofloxacine et la ceftazidime sont les antibiotiques les plus actifs sur les différentes Entérobactéries avec respectivement 100%, 91% et 88% de bactéries sensibles ; les différentes souches présentent un niveau de résistance élevé à lamoxicilline (90%), à la pipéracilline (79%), à la céfazoline (75%) et au triméthoprime/sulfaméthoxazole (74%).
En vue de détecter les espèces bactériennes productrices de BLSE, 69 souches résistantes à au moins une céphalosporine de 3ème génération ou au monobactame ont été soumises au test de double synergie. Trente-huit (31 entre 1995-1998 ; 7 en 2002) souches ont montré un test positif. La prévalence des souches productrices de BLSE est de 12% (31/259). Ces souches présentant un phénotype BLSE sont observées chez toutes les espèces dEntérobactéries étudiées avec une prévalence de 18,8% (Klebsiella spp.), de 17,6% (Citrobacter spp.), de 14,3% (E. coli) et de 1,8% (Proteus spp.).
Parmi les 38 souches potentiellement productrices de BLSE, 18 (47,4%) ont transféré le gène de résistance des oxyimino-céphalosporines aux souches E. coli HK 225, K12 et DH5α. Seize de ces gènes ont été transférés par conjugaison et deux par transformation. Le transfert de gène de BLSE a été co-transféré avec le gène de résistance à la gentamicine et/ou au triméthoprime/sulfaméthoxazole. Toutes les souches transconjugantes et transformantes ont présenté un phénotype BLSE et ont été toutes sensibles à la céfoxitine et à limipénème.
Les extraits enzymatiques bruts obtenus par sonication des souches transconjugantes, transformantes et cliniques ont été capable de réduire les diamètres dinhibition autour des disques de pénicillines, céphalosporines 1ère à la 3ème génération ou monobactame en utilisant une souche dE. coli complètement sensible aux antibiotiques, mais nont pas eu deffet sur ces zones autour des disques dimipénème, de céfoxitine et damoxicilline/acide clavulanique. La détermination des points isoélectriques (pIs) des différentes souches après transfert du gène de résistance par la technique disoélectrofocalisation a montré que les souches transconjugantes et transformantes produisent des β-lactamases dont les pIs varient de 5,4 à 8,8. En effet, 12 souches produisent les BLSE de pI 8,2 ; deux souches en plus de cette BLSE produisent deux autres enzymes de pIs 5,4 et 8,5. Les souches de phénotypes CTX-M produisent soit une enzyme (pI 8,4 ; une souche) soit deux (pIs 7,3, 8,8 ; 2 souches) ou alors 3 types (pIs 5,4 ; 7,3 et 8,8 ; une souche).
Les extraits dADN de 19 souches (16 transconjugantes, 2 transformantes et 1 souche clinique) soumis à la technique de PCR, PCR/NheI, en utilisant les amorces spécifiques des gènes blaSHV, blaCTX-M, blaTEM et blaOXA ont montré que les différents extraits contiennent les gènes des b-lactamases du type SHV (sulfhydryl variable), CTX-M (cefotaximase), TEM (Temoniera) et OXA (aoxacillinase). Lanalyse de la séquence des différents produits de PCR a permis de montrer que : 14 souches produisent la BLSE SHV-12, cinq la BLSE CTX-M (CTX-M-1, une souche ; CTX-M-15, 4 souches) ; quatre souches produisent en association avec les BLSE les β-lactamases TEM-1 (SHV-12, 2 souches ; CTX-M-15, 2 souches) OXA-30 (CTX-M-15, 4 souches). Lanalyse des profils de digestion des plasmides portant les gènes blaCTX-M par les enzymes de restriction, dhybridation et des profils génotypiques des souches cliniques productrice de ces enzymes par ERIC-PCR a montré que la dissémination de la BLSE CTX-M peut se faire soit par transfert de plasmide (on retrouve le même plasmide chez deux souches différentes, E. coli YC-14 et K. pneumoniae YC-17) soit par la même souche dun patient à un autre (E. coli YC-5 = E. coli YC-2). Létude de lenvironnement génétique de ce gène (blaCTX-M-15) par lanalyse des séquences a montré que CTX-M-15 est codée par deux plasmides multirésistants différents, parmi lesquels un (pYC-5b) porte lélément ISEcp1-blaCTX-M-15 flanqué par un site de réplication constituée de 5 paires de bases et inséré dans le transposon Tn2. Une forme tronquée de cet élément a été identifiée chez lautre plasmide (pYC-14). Les BLSE SHV-12, CTX-M-1 et CTX-M-15 sont décrites pour la première fois au Cameroun.
Dans le but de rechercher de nouveaux inhibiteurs des β-lactamases plus actifs, nous avons étudié deux plantes médicinales, Garcinia lucida (Clusiaceae) et Bridelia micrantha (Euphorbiceae) en vue dévaluer leur activité anti- β-lactamase. Les concentrations inhibant 50 % de l'activité de l'enzyme (CI50) des extraits de G. lucida et B. micrantha sont respectivement de 0,01 mg/ml (β-lactamase P99) et de 0,019 mg/ml (β-lactamase OXA-10) indiquant ainsi une bonne inhibition des β-lactamases par les extraits de ces plantes. Le produit 4 issu de la purification par chromatographie haute performance de lextrait de G. lucida est très actif sur la β-lactamase P99 (CI50 = 0,038 mg/ml) alors que les produits 2' et 3' provenant de lextrait de B. micrantha sont actifs sur lenzyme OXA-10 (CI50 de 0,09 mg/ml et 0,11 mg/ml respectivement). La détermination de la structure des composés actifs de ces deux plantes pourrait être une voie importante dans le développement des inhibiteurs des β-lactamases.
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Bacteria producing extended-spectrum β-lactamase (ESBL) have been reported in many countries, but there is no information on different type of ESBL-producing enterobacteria in Cameroon. More than 290 β-lactamases have been described and divided into four classes (A, B, C and D) and up to now, there is no good inhibitor which can inhibite all classes of β-lactamases.
A total of 267 strains of Enterobacteriaceaae were isolated between 1995-1998 (259 isolates) and 2002 (eight isolates) from pathological products (urines, pus and blood) of patients at the Yaounde Central Hospital. The susceptibility of the isolates to 12 antibiotics (amoxicillin, amoxicillin/clavulanate, piperacillin, imipenem, cefazolin, cefoxitin, cefotaxime, ceftazidime, aztreonam, gentamicin, ofloxacin and trimethoprim/sulfamethoxazole) was determined using the agar diffusion disk method. Imipenem, ofloxacin and ceftazidime were the most active antibiotics against overall enterobacteria with susceptibility rates of 100%, 91% and 88% respectively. High resistance rates were observed to amoxicillin (90%), piperacillin (79%), cefazolin (75%) and trimethoprim/sulfamethoxazole (73%).
Enterobacteria isolates (69) resistant to oxyimino-cephalosporin or monobactam were screened for ESBL production by the double disk (DD) synergy test. Thirty-eight (31 from 1995-1998; seven in 2002) were proved positive to the DD synergy test, suggesting the presence of ESBL. The prevalence of ESBL was 12% (31/259) and ESBL-producing strains were Klebsiella spp. (18.8%), Citrobacter spp. (17.6%), Escherichia coli (14.3%) and Proteus spp. (1.8%).
Of the 38 ESBL-producing strains, 18 (47.4%) were transferred resistance to oxyimino-cephalosporins to E. coli HK 225, K12 and DH5α. Sixteen of these strains were transferred ESBL gene by conjugation and two by transformation. Resistance to gentamicin and/or trimethoprim/sulfamethoxazole was co-transferred. All transconjugant and transformant strains exhibited ESBL phenotype but remained susceptible to cefoxitin and imipenem.
Crude extracts of β-lactamase-producing transconjugants, transformants and clinical strains were able to reduce the diameters of inhibition zones around disks containing penicillins, 1st to 3rd generation cephalosporins or monobactam when tested against a fully susceptible E. coli strains, but had no effect on such zones around cefoxitin-, imipenem- and amoxicillin/clavulanate disks. The determination of isoelectric points (pIs) of the various strains after transfer of resistance determinant showed that transconjugants and transformants strains produced β-lactamases with pIs 5.4 to 8.8. In fact, 12 strains produced β-lactamase with pI 8.2, 2 strains in addition to the above enzyme produced two others enzymes with pIs 5.4 and 8.5. Strains with CTX-M- phenotype produced enzyme (pI 8.4, 1 strain), two (pIs 7.3, 8.8; 2 strains) or three types pIs (5.4, 7.3, 8.8; 1 strain).
PCR, PCR/NheI was performed using total or plasmid DNA from 19 strains as templates, and the primers specific to blaSHV, blaCTX-M, blaTEM and blaOXA. Direct sequencing of PCR products revealed that: 14 strains produced SHV-12 ESBL, 5 CTX-M- ESBL (CTX-M-1, one strain; CTX-M-15, 4 strains); four other strains shared non-ESBL TEM-1 (2 producing-SHV-12 strains and 2 producing-CTX-M-strains) and OXA-30 (4 producing CTX-M-15 strains).
Analysis of restriction patterns of plasmid carrying blaCTX-M gene, hybridization, and genotyping patterns of CTX-M-clinical strains by ERIC-PCR showed that dissemination of blaCTX-M gene could be done by plasmid transfer (same plasmid in different strains, E. coli YC-14 and K. pneumoniae YC-17) or by strains from patient to patient (same strain, E. coli YC-2=E. coli YC-5). Sequence analysis of genetic environment of blaCTX-M-15 revealed that CTXM-15 was encoded by two different multiresistant plasmids, of which one (pYC-5b) carried an ISEcp1-blaCTX-m-15 element flanked by five bp target site duplication and inserted within a Tn2-derived sequence. A truncated form of this element in the second plasmid (pYC-14) was identified. ESBLs SHV-12, CTX-M-1, CTX-M-15 are described for the first time in Cameroon.
In our effort to find new active β-lactamase inhibitors, we investigated two medicinal plants, Garcinia lucida (Clusiaceae) and Bridelia micrantha (Euphorbiaceae) for anti- β-lactamase activity. The extracts from G. lucida and B. micrantha exhibited good inhibition of β-lactamase P99 (IC50, 0.01 mg/ml) and OXA-10 (IC50, 0.02 mg/ml) respectively. Purified products from these plants by high performance liquid chromatography showed that, product 4 from G. lucida is very active on β-lactamase P99 (IC50, 0.03 mg/ml) whereas products 2 and 3 from B. micrantha are active on OXA-10 (IC50, 0.09 mg/ml; 0.11 mg/ml respectively). The structural elucidation of the active constituents of these plants will provide useful leads in the development of β-lactamase inhibitors.
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Développement de nouveaux outils de détection des bacilles à Gram négatif résistants à la colistine / Development of new tools for detection of colistin-resistant Gram-negative rodsBardet, Lucie 24 November 2017 (has links)
La découverte récente du premier gène de résistance plasmidique à la colistine mcr-1 a mis en évidence le besoin urgent d'améliorer la détection des isolats résistant à la colistine dans les laboratoires de microbiologie clinique afin de pouvoir rapidement isoler les patients porteurs. L’objectif de ma thèse a ainsi été de répondre à cette problématique par le développement et l’évaluation d’outils spécifiques. Une revue a été rédigée visant à résumer les nouveaux outils développés pour détecter la résistance aux polymyxines, y compris la présentation des méthodes actuelles phénotypiques, antibiogrammes et génotypiques. Le milieu de culture LBJMR a été développé pour détecter toutes les bactéries à Gram négatif résistantes à la colistine et également les souches d’entérocoques résistants à la vancomycine qui représentent un autre problème majeur de santé publique. LBJMR est polyvalent et a permis de dépister 3 bactéries d'intérêt clinique à partir d’un même échantillon: E. coli et K. pneumoniae résistantes à la colistine, et E. faecium résistant à la vancomycine. Un brevet a été déposé. Le kit UMIC Colistine est un dispositif commercial de détermination de la CMI basé sur la méthode de référence. Évalué conformément à la norme ISO 20776, sa sensibilité était excellente pour la détection des souches porteuses du gène mcr-1. Le kit UMIC Colistine constitue ainsi une méthode rapide et fiable pour évaluer la CMI des isolats cliniques dans les laboratoires de microbiologie clinique. Enfin, mes travaux de thèse ont compris l’analyse d’une souche de K. pneumoniae hétérorésistante à la colistine et la description d’une nouvelle espèce bactérienne : Pseudomonas massiliensis. / The recent discovery of mcr-1, the first plasmid-mediated colistin resistance gene, highlighted the urgent need to implement the detection of colistin-resistant isolates in clinical microbiology laboratories, in order to isolate carrier patients. My thesis aimed to address this issue by developing and evaluating specific tools. A review was redacted to summarize the new tools developed to detect polymyxin resistance including the current phenotyping, susceptibility testing and genotyping methods. The LBJMR culture medium has been developed to detect all colistin-resistant Gram-negative bacteria and also the vancomycin-resistant enterococci which represent another major problem of public health. The LBJMR medium allowed the detection of different bacteria of interest from the same clinical sample: colistin-resistant E. coli and K. pneumoniae and also a vancomycin-resistant E. faecium. This project led to a patent filing. The UMIC Colistine kit is a ready-to-use device based on the reference method to determine the polymyxin MIC. Evaluated in accordance with ISO 20776 standard, its sensitivity was excellent for the detection of colistin-resistant strains harboring the mcr-1 gene. The UMIC Colistin system is a rapid and reliable method to determine colistin MIC of clinical isolates in clinical microbiology laboratories. My thesis project also included the analysis of a colistin-heteroresistant Klebsiella pneumoniae strain, and the description of a new bacteril species, Pseudomonas massiliensis. These studies highlight the need to improve the detection of colistin-resistant strains by using reliable methods, suitable for diagnosis in clinical microbiology laboratories.
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Diagnostic rapide de la tuberculose pulmonaire par isolement et culture de Mycobacterium tuberculosis / Rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis by isolation and culture of Mycobacterium tuberculosisGhodbane, Ramzi 26 November 2013 (has links)
Mycobacterium tuberculosis est la cause d’une des maladies infectieuses les plus fréquentes dans le monde causant la mort de plus de 1,2 millions de personnes chaque année selon l’organisation mondiale de la santé (OMS). Actuellement, la tuberculose à M. tuberculosis émerge chez d’autres espèces comme l’a montré notre revue bibliographique des cas de tuberculose à M. tuberculosis chez les primates non-humains, les éléphants d’Asie, les animaux de ferme, les animaux de compagnie et certains animaux sauvages. Nous avons montré que ces trois espèces survivent dans le sol pendant au moins 12 mois et restent pathogènes dans un modèle souris. Egalement nous avons montré que le sol infecté par M. tuberculosis est une source potentielle de contamination pour les animaux. Nous avons ensuite développé un protocole de culture rapide de M. tuberculosis, incluant un nouveau milieu de culture solide, des conditions optimisées d’incubation, et la détection des microcolonies par autofluorescence. Notre travail de thèse a permis de mettre en place des techniques et protocoles qui révolutionnent la culture et l’isolement de M. tuberculosis en réduisant les délais de culture et des antibiogrammes, un point déterminant pour la lutte contre la tuberculose notamment dans les pays à ressources limitées et les pays à forte émergence de souches de M. tuberculosis de plus en plus résistantes. Ces protocoles sont en cours de transfert pour la routine de laboratoire. / Mycobacterium tuberculosis is the cause of one of the most common infectious diseases in the world killing more than 1.2 million people each year according to the World Health Organization (WHO). Currently, M. tuberculosis tuberculosis emerges in other species like non-human primates, Asian elephants, farm animals and some wild animals. We have shown that three species of M. tuberculosis complex survive in the soil for at least 12 months and are pathogenic in a mouse model and M. tuberculosis-infected soil is a potential source of infection for animals. We then developed a protocol for rapid culture of M. tuberculosis, including a new solid culture medium, optimized conditions of incubation, and detection of microcolonies by autofluorescence. Our thesis has helped develop techniques and protocols that are revolutionizing the culture and isolation of M. tuberculosis by reducing delays culture and susceptibility testing, a crucial point for the fight against tuberculosis, especially in countries limited resources and countries with strong emergence of M. tuberculosis strains more resistant. These protocols are being transferred to the routine laboratory.
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