Mainz, Universiẗat, Diss., 2002.

Thesis (doctoral)--Universität Hohenheim, 2003.

Zugl.: Kiel, Univ., Diss., 2007

Zugl.: Braunschweig, Techn. Univ., Diss., 2008 / Enth. 6 Sonderabdr. aus verschiedenen Zeitschr. und anderen Publ. - Beitr. teilw. dt., teilw. engl.

Universiẗat, Diplomarb., 2007--Kassel.

München, Techn. Universiẗat, Diss., 2007.

Würzburg, Univ., Diss., 2008 / Zsfassung in engl. Sprache

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Berlin.

Der aus der in Frankreich kultivierten Meeres-Kiefer (Pinus pinaster) gewonnene und standardisierte Rindenextrakt Pycnogenol enthält neben Procyanidinen auch weitere polyphenolische sekundäre Naturstoffe und ist zudem weltweit als USP-gelistetes Nahrungsergänzungsmittel kommerziell erhältlich. Der Konsum von polyphenolreichen Lebensmitteln ist ebenso wie die Einnahme von Pycnogenol mit einer Vielzahl von positiven Effekten bei verschiedenen pathophysiologischen Prozessen assoziiert. Dazu zählen beispielsweise antioxidative oder antiinflammatorische Wirkungen, welche sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet werden konnten. Bislang gelang es nach der Einnahme des Extraktes nicht alle in Humanserum oder -plasma detektierten Substanzen zu identifizieren; zudem ist nicht geklärt, von welchen Stoffen konkret eine Bioaktivität ausgeht oder ob diese durch synergistische Effekte zustande kommt. Aus diesen Gründen sollten in der vorliegenden Arbeit im Rahmen einer Klinischen Studie bislang nicht beschriebene Analyten in Humanserum mittels UHPLC-qTOF-MS charakterisiert werden. Hierbei wurde ein ungerichteter, metabolomischer Ansatz gewählt. Die Studienproben der Proband*innen wurden dabei also ohne etwaige Restriktionen analysiert, beispielsweise hinsichtlich möglicher Molekülstrukturen oder der Retentionszeiten der detektierten Analyten. Näher betrachtet werden sollten Analyten, die in einer individuellen Serumprobe nach Beginn der viertägigen Pycnogenol-Einnahme neu auftraten. In Anschluss an eine Probenvorbereitung mittels methanolischer Proteinpräzipitation im sauren Milieu konnten in dem Humanserum der Proband*innen im ESI-Positiv-Modus fünf und im ESI-Negativ-Modus 23 interessante Analyten nachgewiesen werden, die auf die Einnahme von Pycnogenol zurückzuführen waren. Elf dieser Substanzen konnte eine Struktur zugeordnet werden, wobei alle ausschließlich als Sulfatkonjugate vorlagen. Zu diesen zählten neben Zimtsäure-Derivaten wie Ferulasäure-Sulfat zudem Flavonoide, z. B. Taxifolin-Sulfat, aber auch Phenylvaleriansäure-Abkömmlinge, beispielsweise Hydroxydihydroxyphenylvaleriansäure-Sulfat, sowie Vertreter aus der Gruppe der Benzoesäuren und weitere Aromaten wie z. B. Pyrogallol-Sulfat oder Protocatechusäure-Sulfat. Nach unserem besten Wissen war der Aspekt der ausschließlichen Sulfatierung neuartig. Wie aufgrund des interindividuell variablen Metabolismus zu erwarten, insbesondere durch das enterale Mikrobiom, war die Verteilung dieser sogenannten Marker innerhalb der 15 Studienteilnehmenden sehr heterogen. Nicht jeder Marker wurde bei jeder Person erfasst; die Spannweite reichte dabei von einem Teilnehmenden im Falle des mikrobiellen Metaboliten Hydroxyphenylvaleriansäure-Sulfat bis hin zu 14 Proband*innen bei einer nicht-identifizierbaren, jedoch wahrscheinlich endogenen Substanz im ESI-Positiv-Modus. Am häufigsten wurden die elf zuordenbaren Analyten vier Stunden nach der Einnahme von Pycnogenol über einen Zeitraum von vier Tagen bestimmt. Im Anschluss sollte die Bioaktivität dieser Substanzen in einem endothelialen Zellkulturmodell untersucht werden. Das Endothel wurde als Zielstruktur gewählt, da eine endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese einer Reihe von Krankheiten mit ausgeprägter Mortalität und Morbidität eine bedeutende Rolle spielt. Zudem wurde bereits eine positive Wirkung auf die Endothelfunktion nach der Einnahme von Pycnogenol beschrieben, wobei bis dato der Mechanismus auf molekularer Ebene unklar war. Die Charakterisierung der Sulfatkonjugate bezüglich ihrer Bioaktivität ex vivo mit humanen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) gestaltete sich herausfordernd. Initial sollte untersucht werden, inwiefern diese Substanzen einer durch einen Entzündungsstimulus hervorgerufenen Schädigung der endothelialen Glycocalyx entgegenwirken oder diese vermeiden können. Allerdings ließen sich mit den verschiedenen inflammatorischen Stimuli Lipopolysaccharid (LPS), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Wasserstoffperoxid bezüglich Konzentration und Inkubationsdauer keine reproduzierbaren Kulturbedingungen für eine valide ELISA-Quantifizierung des endothelialen Markers Heparansulfat etablieren. Im Anschluss erfolgte unter dem Einfluss einer TNF-α-Stimulation ein orientierendes Screening mit den Monosubstanzen Ferulasäure und Protocatechusäure bzw. mit deren Sulfatkonjugaten in Konzentrationen von 0,1 und 0,5 µM. Dabei zeigten die Konjugate beider Analyten bei der niedrigeren Konzentration tendenziell eine glycocalyx-protektive Wirkung, welche bei der höheren Konzentration jedoch nicht mehr beobachtet werden konnte. Die endotheliale Permeabilität wurde mittels eines FITC-Dextran-Permeabilitäts-Assays untersucht. Hiermit sollte ebenfalls ein möglicher endothel-protektiver Einfluss der sulfatierten Substanzen unter entzündlichen Bedingungen (TNF-α-Stimulation) beleuchtet werden. Jedoch konnte weder bei Ferulasäure oder Protocatechusäure noch bei deren Sulfatkonjugate oder Taxifolin in diesem Modell ein Einfluss auf die endotheliale Barrierefunktion erfasst werden. Ursprünglich war abschließend geplant in einem ex vivo-Modell die Humanserum-Proben mit dem darin enthaltenen Gemisch aus möglicherweise bioaktiven Metaboliten direkt im Zellkulturmodell auf ihre Wirkung zu testen. Dies hat den Vorteil, dass simultan synergistische Effekte und Einflüsse der Matrix untersucht werden können und ausschließlich in vivo erreichbare Konzentrationen eingesetzt werden. Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit der Studienproben und der oben geschilderten heterogenen Ergebnisse wurde auf eine weitere Analyse im Rahmen eines ex vivo-Modells verzichtet. Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Einnahme von Pycnogenol resorbierte Bestandteile und Metabolite in Humanserum ausschließlich als Sulfatkonjugate vorlagen. Zudem wurde bezüglich der Evaluation der endothelialen Bioaktivität durch Polyphenole eine Grundlage für weitere Untersuchungen geschaffen. Damit konnte ein Beitrag zur pharmakokinetischen und -dynamischen Charakterisierung von Pycnogenol geleistet werden. / Pycnogenol is a standardized bark extract from the French maritime pine Pinus pinaster, which is monographed in the USP as a dietary supplement. The main components are procyanidins as well as other polyphenolic secondary metabolites. The consumption of polyphenol-rich food or extracts is associated with miscellaneous beneficial effects in different pathophysiological processes. This accounts for the intake of Pycnogenol as well, which exhibits antioxidant and antiinflammatory effects both in vitro and in vivo. So far, not all analytes detected in human serum or plasma could be identified after ingestion of the bark extract; additionally, the exact bioactive compounds are unknown as well as probable synergistic effects. Therefore, the aim of the present thesis was the UHPLC-qTOF-MS-identification of previously unidentified analytes in human serum of fifteen volunteers in a clinical study. Study samples were analyzed using an untargeted, metabolomic approach without any predefined restrictions regarding possible chemical structures or the retention times of the detected analytes. Analytes which were tracked in individual serum samples after the start of a four-day course of Pycnogenol-intake were to be further characterized. Human serum of the subjects was analyzed by UHPLC-qTOF-MS after protein precipitation with methanol acidified with formic acid. In total, five analytes in ESI positive mode and 23 in negative mode were detected, which were related to the intake of Pycnogenol. Eleven of these substances were assigned a molecular structure, all of them were exclusively sulfate conjugates. These included cinnamic acid derivates such as ferulic acid sulfate as well as flavonoids, e.g., taxifolin sulfate, but also phenylvaleric acid metabolites, for example hydroxydihydroxyphenylvaleric acid sulfate, and additionally benzoic acids and other aromatic compounds such as pyrogallol sulfate or protocatechuic acid sulfate. To the best of our knowledge, the exclusive presence of sulfate conjugates has never been reported before. The distribution and presence of the features differed greatly within the study participants. This fact was to be expected based on marked interindividual variable metabolism, especially by gut microbiota. Not every analyte was detected in every subject; hydroxyphenylvaleric acid sulfate was identified in only one person, whereas an unknown marker appeared in 14 subjects in ESI positive mode, which was presumably an endogenous compound. Most of the eleven analytes mentioned above were detected four hours after the last ingestion of a 4-day-course. Subsequently, a comprehensive characterization of these compounds with respect to their effects on the endothelium in a cell culture model was planned. Endothelial dysfunction plays a significant role in the pathogenesis of a variety of diseases with marked mortality and morbidity. For this reason, the endothelium was chosen as a target for these assays. Several beneficial effects on endothelial function in vitro and in vivo had already been reported after Pycnogenol-ingestion, although the precise mechanism at the molecular level was not known. The ex vivo bioactivity characterization of the sulfate conjugates in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was challenging. Initially, it was planned to investigate a probable protection from endothelial glycocalyx damage induced by different inflammatory stimuli. Heparan sulfate, an integral part of the endothelial glycocalyx, was chosen to be the target for ELISA-quantification. However, the establishment of reproducible cell culture conditions was not possible, neither with the application of lipopolysaccharide (LPS) nor tumor necrosis factor α (TNF-α) or hydrogen peroxide. A screening performed with both sulfated and unconjugated ferulic acid and protocatechuic acid at a concentration of 0.1 and 0.5 μM did not show any promising result regarding protection of the endothelium under TNF-α initiated inflammation. At the lower concentration, both sulfate conjugates appeared to exhibit a slight glycocalyx-protective effect, whereas this was not observed at higher concentration. Subsequently, endothelial permeability was assessed under inflammatory conditions (stimulation with TNF-α) by FITC-dextran-transport. Neither ferulic acid nor protocatechuic acid or their sulfate conjugates nor taxifolin protected the endothelial barrier function in this model. Originally, it was planned to evaluate human serum samples containing all possibly bioactive compounds in an ex vivo model; in this set up, human serum is applied directly to cell culture in order to examine effects. Firstly, synergistic actions of different analytes and the effect of matrix on bioactivity can be measured. Secondly, only physiologic relevant concentrations are used. However, due to the limited availability of the study samples and the previously mentioned heterogeneous results, this approach was not further pursued. As a summary, the present work revealed that absorbed components and metabolites after the ingestion of Pycnogenol were exclusively present as sulfate conjugates in human serum. In addition, a base for further bioactivity studies of polyphenols with respect to endothelial function was established. Therefore, this work contributed to the pharmacokinetic and pharmacodynamic characterization of Pycnogenol.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Umfang der gastrointestinalen Absorption und Metabolisierung von mit der Nahrung aufgenommenen Polyphenolen in vivo zu ermitteln. Darüber hinaus sollte deren systemische Verfügbarkeit anhand von humanen Serum- und Urinproben bestimmt werden. Lebensmittel der Wahl war dabei Apfelsaft. Die Identifizierung und Strukturaufklärung der Polyphenole und ihrer Metabolite erfolgte mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion (HPLC-DAD), HPLC-Elektrospray-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS) sowie Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS). Quantitative Analysen wurden mittels HPLC-DAD durchgeführt; für die Bestimmung der Polyphenolgehalte in Urinproben sowie von D-(-)-Chinasäure wurde die HPLC-ESI-MS/MS im Single Reaction Monitoring (SRM) Modus eingesetzt. Zur Etablierung der Polyphenolanalytik und zur Auswahl eines für die Studien geeigneten Saftes wurden die Polyphenolprofile verschiedener Presssäfte aus Most- und Tafeläpfeln sowie kommerziell erhältlicher Apfelsäfte ausgewertet. Für die Säfte aus Tafeläpfeln wurden Polyphenolmengen zwischen 154 und 178 mg/L bestimmt, wohingegen die Säfte aus Mostäpfeln Gehalte zwischen 261 und 970 mg/L aufwiesen. Bei den Säften des Handels wiesen die naturtrüben Apfelsäfte mit 182 bis 459 mg/L höhere Polyphenolgehalte auf als die klaren Produkte (120 - 173 mg/L). Bei oraler Aufnahme kommen die Polyphenole zuerst mit Speichel in Kontakt. Umsetzungen mit zentrifugiertem Speichel führten zu keiner Modifikation der Substanzen. In Gegenwart von nativem Speichel wurden für die ß-glycosidisch gebundenen Flavonoidglycoside hydrolytische Abbaureaktionen in Abhängigkeit der Struktur ihres Zuckerrestes beobachtet. Nach Antibiotikumzugabe wurden deutlich geringere Abbauraten ermittelt. Die Hydrolyse erfolgt demnach hauptsächlich durch Enzyme der bakteriellen Mundflora. Im Weiteren gelangen die Polyphenole über die Speiseröhre in den stark sauren Magen. Zur Überprüfung ihrer Stabilität wurden die Apfelpolyphenole mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Einzig für Procyanidin B2 wurde ein nahezu vollständiger Abbau nachgewiesen. Nach Passage des Magens erreichen die Polyphenole das neutrale bis leicht alkalische Duodenum. Die Inkubation erfolgte mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden. Für 5-Kaffeoylchinasäure wurde eine 37%ige Abnahme beobachtet. Dabei wurden 3- und 4-Kaffeolychinasäure, Kaffeesäure, D-(-)-Chinasäure sowie Kaffeesäuremethylester generiert. Vergleichbare Ergebnisse wurden bei der Inkubation von 4-p-Cumaroylchinasäure erhalten. Kaffeesäure unterlag einer 26,3%igen Umsetzung zu Ferulasäure, Dihydrokaffeesäure und Kaffeesäuremethylester. Bei den monomeren Flavan-3-olen wurden mittels HPLC-Analytik an chiraler Phase Epimerisierungen nachgewiesen. Procyanidin B2 war nach vier Stunden nur noch in Spuren erfassbar. Quercetin wurde vollständig in Phloroglucin, 3,4-Dihydroxybenzoesäure und 2,4,6-Trihydroxybenzoesäure gespalten. Um die Verfügbarkeit der Polyphenole im Dickdarm zu untersuchen, wurde eine Interventionsstudie mit naturtrübem Apfelsaft bei Probanden mit einem Stoma des terminalen Ileums durchgeführt. Nach oraler Aufnahme von einem Liter Saft wurde der Ileostomaausfluss über einen Zeitraum von acht Stunden gesammelt. In den Ileostomabeuteln wurden zwischen Null und 33,1% der einzelnen aus dem Apfelsaft aufgenommenen phenolischen Substanzen wiedergefunden. Der ausgeschiedene Anteil der Flavonoidglycoside war dabei abhängig von der Struktur des jeweiligen Zuckerrestes. Als Metabolite waren D-(-)-Chinasäure, 1- und 3-Kaffeoylchinasäure, Phloretin und dessen 2´-O-Glucuronid sowie die Methylester der Kaffee- und p-Cumarsäure nachweisbar. Für die höhermolekularen Procyanidine wurden Wiederfindungen von 90,3% sowie deren partieller Abbau ermittelt. Die systemische Verfügbarkeit der Polyphenole sowie ihre renale Ausscheidung wurden in zwei weiteren Humanstudien mit gesunden Probanden untersucht. Nach Konsum von einem Liter naturtrüben Apfelsaft erfolgten Blutabnahmen über einen Zeitraum von acht Stunden; Urin wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die Bilanzierung der Apfelpolyphenole erfolgte sowohl vor als auch nach enzymatischer Hydrolyse. Kaffeesäure, 5-Kaffeoylchinasäure, 4-p-Cumaroylchinasäure, (-)-Epicatechin, Phloretin und Quercetin waren sowohl im Serum als auch im Urin detektierbar. Insgesamt wurden 5,3% (Serum) bzw. 23% (Urin) der mit dem Saft aufgenommenen phenolischen Verbindungen wiedergefunden. Davon waren im Urin 19,5% in Form hydroxylierter phenolischer Säuren nachweisbar. / The objective of the present work was to determine the amount of gastrointestinal absorption and metabolism of polyphenols after food consumption in vivo. Furthermore, their systemic availability should be determined by serum and urine samples.. The food under study was apple juice. Identification and structural elucidation of polyphenols and their metabolites were performed by high-performance liquid chromatography diode-array detection (HPLC-DAD), HPLC electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) as well as high-resolution gas chromatography mass spectrometry (HRGC-MS). Quantitative analyses were performed by HPLC-DAD; for the quantitation of polyphenol contents in the urine samples under study as well as the D-(-)-quinic acid, HPLC-ESI-MS/MS in the single reaction monitoring (SRM) mode was used. For the establishment of polyphenol analysis and for the selection of a suitable juice for the studies, the polyphenol profiles of different pressed juices of cider and dessert apples as well as commercially available apple juices were analysed first of all. For the juices from dessert apples polyphenol amounts ranged between 154 and 178 mg/l, whereas the juices from cider apples showed contents between 261 and 970 mg/l. Among commercially available juices, with 182 to 459 mg/l cloudy apple juices showed higher contents than the clear products (120 - 173 mg/l). By oral consumption, polyphenols come first into contact with saliva. Conversions with centrifuged saliva led to no modification of the substances. In the presence of whole saliva in ß-glycosidic bound flavonoid glycosides hydrolytic decomposition reactions in dependence of their sugar moiety were observed. After the addition of antibiotic, smaller degradation rates were clearly determined. Thus, hydrolysis resulted mainly from the enzymes of the oral bacterial flora. Afterwards, the polyphenols reach the highly acid stomach via the oesophagus. For examination of their stability the apple polyphenols were incubated with artificial gastric juice (pH 1.81) for four hours. Only for procyanidin B2 an almost complete decomposition was demonstrated. Following the passage of the stomach the polyphenols reach the neutral to slightly alkaline duodenum. Incubations were performed with simulated duodenal secretion (pH 7.2) over a period of 24 hours. For 5-caffeoylquinic acid, a decomposition of 37% was observed. Thereby,3- and 4-caffeoylquinic acid, caffeic acid, D-(-)-quinic acid as well as caffeic acid methyl ester were generated. Comparable results were received with the incubation of 4-p-coumaroylquinic acid. 26.3% of the caffeic acid underwent a conversion to ferulic acid, dihydrocaffeic acid and caffeic acid methyl ester. For monomeric flavan-3-ols epimerisation was demonstrated by HPLC analytics using a chiral phase. Only traces of procyanidin B2 were detectable after four hours. Quercetin was split completely into phloroglucinol, 3,4-dihydroxybenzoic acid and 2,4,6-trihydroxybenzoic acid. In order to investigate the availability of polyphenols in the large intestine, an intervention study with cloudy apple juice was accomplished by volunteers with a terminal ileostomy. After oral intake of one litre of juice the ileostomy discharge was collected over a period of eight hours. Between zero and 33.1% of the particular phenolic substances absorbed from the apple juice were recovered in the ileostomy bags. The excreted amount of the flavonoid glycosides depended thereby on the structure of the respective sugar moiety. As metabolites, D-(-)-quinic acid, 1- and 3-caffeoylquinic acid, phloretin and its 2´-O-glucuronide as well as the methyl ester of the caffeic and p-coumaric acid were detectable. For the high-molecular procyanidins recoveries of 90.3% as well as their partial decomposition were detected. The systemic availability of polyphenols as well as their renal elimination was investigated in two further human studies with healthy volunteers, respectively. After consumption of one litre of cloudy apple juice blood samples were taken over a period of eight hours; urine was analysed over a period of 24 hours. The measurement of the apple polyphenols was carried out both before and after enzymatic hydrolysis. Caffeic acid, 5-caffeoylquinic acid, 4-p-coumaroylquinic acid, (-)-epicatechin, phloretin and quercetin were detectable both in serum and urine. Alltogether 5.3% (serum) and 23.0% (urine) of the phenolic compounds consumed with the juice were recovered. In the urine, 19.5% of that was determined in form of hydroxylated phenolic acids.