Einleitung: Verschiedene Erkrankungen gehen bei Pferden mit einer erhöhten Entzündungsbereitschaft einher. Das entzündliche Geschehen kann dabei in engem Zusammenhang mit dem Auftreten von Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER) stehen. Im Zuge der Immunantwort entsteht eine Signalkaskade, die über Entzündungsmarker quantifiziert werden kann. Bei der Expression verschiedener Entzündungsmediatoren rückt insbesondere die Leber in den Fokus. Die anti-inflammatorische und ER-Stress-modifizierende Wirkung von oralen Polyphenolen aus einem Grüntee-Kurkuma-Extrakt (GKE) wurde bereits in anderen Tierspezies, wie z.B. Wiederkäuern oder Schweinen nachgewiesen. Ziel der Studie: Das Ziel der vorliegenden Studie war die Überprüfung der Effekte einer GKE-Supplementierung auf eine Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Entzündung bei Pferden und Ponys. Die Hypothese war, dass die Supplementierung des GKE zu einer Reduktion der entzündlichen Reaktion und des Zellstresses bei Pferden und Ponys führt. Tiere, Material und Methoden: In einer randomisierten, placebo-kontrollierten Studie wurden fünf gesunde adulte Warmblutpferde (Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung, Alter 19 ± 5 Jahre; Körpermasse (KM) 589 ± 81 kg) und sechs gesunde adulte Shetlandponys (Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung, Alter 9 ± 3 Jahre; KM 126 ± 8 kg) einbezogen. Die tägliche Basisration bestand aus Heu (2 kg/100 kg KM). Im Cross-over erhielten die Tiere für 21 Tage 10 g eines GKE (20% Polyphenolgehalt) nach Angaben des Herstellers, oder alternativ ein Placebo (Kalziumcarbonat) zusammen mit 1 kg (Pferde) oder 0,2 kg (Ponys) eines kommerziellen Ergänzungsfuttermittels für Pferde. Nach der 21-tägigen Supplementierungsphase wurde bei allen Tieren zur Induktion eines moderaten, generalisierten Entzündungsgeschehens LPS (10 ng/kg KM) intravenös appliziert. 24 Stunden vor und 12 Stunden nach der LPS-Challenge wurden Blutproben und Lebergewebe entnommen. Die Entnahme des Lebergewebes erfolgte minimalinvasiv unter Ultraschallkontrolle. Während der anschließenden 3-monatigen Wash-out Phase erhielten alle Tiere ausschließlich Heu zur freien Aufnahme. Hiernach fand im Cross-over Verfahren ein Wechsel der Fütterungsgruppen statt. Eine erneute LPS-Challenge und die anschließende Probennahme wurden nach den oben genannten Kriterien durchgeführt. In allen Blutproben wurden die Parameter Serum Amyloid A (SAA), Haptoglobin (Hp) und Retinol-bindendes Protein 4 (RBP4) gemessen. Mittels RT-qPCR wurden in allen Leberbioptaten die mRNA-Level ausgewählter Entzündungsmarker bestimmt (Hp, TNF-α, IL-1β, IL-6, CD68, FGF21, NF-kB, ATF4). Zusätzlich erfolgte eine histologische Untersuchung auf entzündliche Reaktionen im Gewebe. Die Daten, mit Ausnahme der immunhistochemischen Auswertungen, wurden unter Verwendung der kommerziellen Software Statistica® statistisch ausgewertet. Die Daten wurden mittels des Shapiro-Wilks-Testes auf Normalverteilung überprüft. Da die Daten nicht normalverteilt waren, wurde der Wilcoxon-Test für nicht-parametrische Daten angewendet. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Die Darstellung der Daten erfolgt als Median und dem 25./75. Perzentil. Ergebnisse: Vor der LPS-Challenge lagen alle Werte für SAA ≤ 2,6 mg/l. Nach der LPS-Challenge stiegen die Werte signifikant an (Angabe Median und in Klammern 25./75. Perzentil, Placebo-Gruppe: 98,4 (70,2/118) μg/ml, Zeit p = 0,008; GKE-Gruppe: 70,7 (46,8/111) μg/ml, Zeit p = 0,003). Innerhalb der GKE-Gruppe stieg der Wert für Hp im Serum nach der LPS-Challenge signifikant an (Zeit p = 0,005). Es konnten keine weiteren signifikanten Unterschiede in den Blutparametern im Vergleich der GKE-Gruppe zur Placebogruppe nach LPS Stimulation gefunden werden. Im Lebergewebe zeigte sich nach der LPS-Challenge für die GKE-Gruppe eine 2,6-fach geringere mRNA-Expression für das pro-inflammatorische Zytokin IL-1β im Vergleich zur Placebogruppe (Supplementierung p = 0,04). Die mRNA-Level von CD68 (Zeit p = 0,04) und Hp (Zeit p = 0,03) zeigten nach der LPS-Challenge im Lebergewebe einen signifikanten Anstieg innerhalb der Placebogruppe. Innerhalb der GKE-Gruppe zeigten sich keine Veränderungen durch die LPS-Challenge. Ein signifikanter Unterschied zwischen der Placebo- und der GKE Gruppe nach LPS wurde nicht gefunden. Andere Parameter im Lebergewebe, wie z.B. Transkriptionsfaktor NF-κB und die Zytokine IL-6 und TNF-α, zeigten keine signifikanten Veränderungen nach der LPS-Challenge in beiden Fütterungsgruppen. Für die Ergebnisse der Immunhistochemie konnten keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit zur LPS-Challenge oder der Fütterung gezeigt werden. Schlussfolgerung: Die LPS-Challenge induzierte eine generalisierte Entzündung bei Pferden und Ponys. Die Supplementierung eines GKE für 21 Tage zeigte über die Reduktion des Entzündungsmarkers IL-1β in der Leber ein anti-inflammatorisches Potential. Andere Blut- und Leberparameter zeigten keinen Supplementierungseffekt. Somit konnte kein umfassender anti-inflammatorischer Effekt der GKE Supplementierung festgestellt werden.:1 Introduction 2 Literature review 2.1 Inflammation 2.1.1 Acute phase reaction 2.1.1.1 Serum amyloid A 2.1.1.2 Haptoglobin 2.1.1.3 Retinol-binding protein 4 2.1.2 Transcription factor NF-κB 2.1.2.1 Pro-inflammatory cytokines (Il-1β, IL-6, TNF-α) 2.1.3 Macrophages 2.1.3.1 Cluster of differentiation 68 2.2 Stress of the endoplasmic reticulum 2.2.1 Fibroblast growth factor 21 2.2.2 Activating transcription factor 4 2.3 Oxidative stress 2.4 Polyphenols 2.4.1 Green tea 2.4.2 Curcuma 2.4.3 Bioavailability 2.4.4 Anti-inflammatory effects 2.4.5 Antioxidative effects 3 Publication 3.1 Effects of a blend of green tea and curcuma extract supplementation on lipopolysaccharide-induced inflammation in horses and ponies 4 Discussion 4.1 Effects of the LPS challenge 4.1.1 Induction of inflammation by LPS 4.1.2 Induction of ER stress and oxidative stress by LPS 4.2 Effects of the GCE supplementation 4.2.1 Anti-inflammatory effects 4.2.2 Reduction of ER stress and oxidative stress 4.2.3 Comparison of in vivo effects in equines and farm animals 4.3 Daily dosages of polyphenols 4.4 Conclusion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 References 8 Appendix 8.1 List of presentations as part of this thesis 8.2 Further publications 8.2.1 Published articles 8.2.2 Published conference contributions 9 Acknowledgement / Introduction: Different medical conditions are linked with an inflammatory status in horses and ponies. Inflammation can be induced by endoplasmic reticulum (ER) stress, leading to an immune response which can be measured by several markers of the signalling cascade. The liver plays an important role as production site of these inflammatory markers. The influence of feeding a polyphenol-rich supplement consisting of green tea and curcumin extract (GCE) on ER stress and inflammation has been already described in several species such as cattle and pigs. Aim of the study: The aim of the study was to investigate the effect of a GCE supplementation on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in horses and ponies. It was hypothesized that the GCE supplementation will reduce inflammatory reactions and cell stress compared to the placebo group. Animals, material and methods: In a randomized, placebo controlled study, five healthy adult warmblood horses (mean (±SD) age 19 ± 5 years, mean (±SD) body weight (BW) 589 ± 81 kg) and six healthy adult Shetland ponies (mean (±SD) age 9 ± 3 years and mean (±SD) BW 126 ± 8 kg) were included. Animals were fed daily with meadow hay (2 kg/ 100 kg BW). In a cross-over design, animals were supplemented for 21 days with 10 g of a GCE (20% total polyphenol content) according to manufacturer’s instructions or a placebo (calcium carbonate) in a mixture with 1 kg (horses) or 0.2 kg (ponies) of a commercial feed for horses. After supplementation for 21 days, all animals underwent an intravenous LPS (10 ng/kg BW) challenge to induce a moderate systemic inflammation. 24 hours before and 12 hours after the LPS challenge, blood and liver samples were collected. Liver tissue was taken transcutaneously under ultrasound control. Subsequently, a 3-months-lasting wash-out period was conducted where the animals were fed with meadow hay ad libitum. A change of feeding groups according to the cross-over design was performed. A second LPS challenge and sample collection were performed according to the above-mentioned protocol. All blood samples were analysed for serum amyloid A (SAA), haptoglobin (Hp) and Retinol-binding protein 4 (RBP4). RT-qPCR was used to analyse liver mRNA levels of selected markers of inflammation (Hp, TNF-α, IL-1β, IL-6, CD68, FGF21, NF-kB, ATF4). In addition, liver tissue was histologically examined for inflammatory responses. All data except for immunohistochemical results were statistically assessed with a commercial software package (Statistica). Data were checked for normal distribution using the Shapiro-Wilks test. As data set was not normally distributed the Wilcoxon test for non-parametric data was used for analyses. Level of significance was set at P < 0.05. Data are presented as median and 25./75. percentile. Results: All SAA values before LPS were ≤ 2.6 mg/L. After LPS challenge, all SAA values were significantly higher compared to baseline (data expressed as medians and 25./75. Percentile in brackets, placebo group: 98.4 (70.2/118) μg/mL, time P = 0.008; GCE group: 70.7 (46.8/111) μg/mL, time P = 0.003). GCE group showed a significant increase for serum Hp after LPS challenge (time P = 0.005). Other significant differences in blood parameters comparing placebo and GCE group after LPS could not be found. In the liver, the pro-inflammatory cytokine IL-1β showed a 2.6-fold lower mRNA level after LPS challenge in the GCE group compared to placebo group (supplementation P = 0.04). Hepatic mRNA levels of CD68 (time P = 0.04) and Hp (time P = 0.03) increased significantly in the placebo group, but not in the GCE supplementation group. A significant difference between the two feedings groups after LPS could not be found. Other liver parameters, such as transcription factor NF-κB and the cytokines IL-6 and TNF-α, were not different after LPS challenge in both feeding groups. Immunohistochemical results showed no difference between GCE and placebo group after LPS challenge. Conclusion: The LPS challenge induced inflammation in the horses and ponies. Feeding a GCE for 21 days showed some potential to alter LPS-induced systemic inflammatory responses by reducing mRNA levels of the inflammatory marker IL-1β in liver tissue. Nevertheless, an overall anti-inflammatory effect by GCE was missing, since other blood and liver parameters were not affected by the GCE supplementation.:1 Introduction 2 Literature review 2.1 Inflammation 2.1.1 Acute phase reaction 2.1.1.1 Serum amyloid A 2.1.1.2 Haptoglobin 2.1.1.3 Retinol-binding protein 4 2.1.2 Transcription factor NF-κB 2.1.2.1 Pro-inflammatory cytokines (Il-1β, IL-6, TNF-α) 2.1.3 Macrophages 2.1.3.1 Cluster of differentiation 68 2.2 Stress of the endoplasmic reticulum 2.2.1 Fibroblast growth factor 21 2.2.2 Activating transcription factor 4 2.3 Oxidative stress 2.4 Polyphenols 2.4.1 Green tea 2.4.2 Curcuma 2.4.3 Bioavailability 2.4.4 Anti-inflammatory effects 2.4.5 Antioxidative effects 3 Publication 3.1 Effects of a blend of green tea and curcuma extract supplementation on lipopolysaccharide-induced inflammation in horses and ponies 4 Discussion 4.1 Effects of the LPS challenge 4.1.1 Induction of inflammation by LPS 4.1.2 Induction of ER stress and oxidative stress by LPS 4.2 Effects of the GCE supplementation 4.2.1 Anti-inflammatory effects 4.2.2 Reduction of ER stress and oxidative stress 4.2.3 Comparison of in vivo effects in equines and farm animals 4.3 Daily dosages of polyphenols 4.4 Conclusion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 References 8 Appendix 8.1 List of presentations as part of this thesis 8.2 Further publications 8.2.1 Published articles 8.2.2 Published conference contributions 9 Acknowledgement

Tannine sind pflanzliche, polyphenolische Sekundärmetabolite mit Protein-präzipitierenden und –bindenden Kapazitäten, welche offenbar für die antinutritiven und gesundheitsschädlichen Wirkungen der Tannine verantwortlich sind. Jedoch dominieren in der Literatur die gesundheitsfördernden Beschreibungen, für die meist die antioxidative Kapazität verantwortlich gemacht wurde. Der etablierte Modelorganismus Caenorhabditis elegans wurde zur Analyse dieses Kontrastes ausgewählt. Zunächst wurden Lebensdauer und Stressresistenz der mit Tanninsäure und den Tanninbausteinen Gallussäure, Ellagsäure und Catechin behandelten Nematoden ermittelt. Das vermutete Vorliegen eines „Calorie Restriction“ (CR)-Effektes als auch einer hormetischen Dosis-Wirkungs-Beziehung wurde überprüft. Weiterhin wurden antimikrobielle und antioxidative Eigenschaften als potentielle Ursachen der Langlebigkeit untersucht und die Auswirkungen auf die Fitness und Genexpression analysiert. Die Einbeziehung verschiedener Alterungs-Theorien rundete die Analyse der Tanninwirkung ab. Alle Tannin-Substanzen konnten eine Lebensverlängerung erwirken, doch erstaunlicherweise erwiesen sich Langlebigkeit und Stressresistenz als individuelle, nicht zwangsläufig gekoppelte Parameter. Hormesis, CR-nachahmende Eigenschaften, antimikrobielle Kapazitäten als auch verschiedene stressrelevante Gene sind teilweise für die Lebensverlängerung verantwortlich. Die antioxidative Kapazität scheint jedoch irrelevant zu sein. Die differentielle Expression mehrerer hundert Gene durch Tanninsäure unterstreicht zudem die Komplexität der Wirkweise. Hinweise zur Bestätigung der „Disposable Soma Theory“, der „Mitohormesis“-Theorie und der „Green Theory of Ageing“ konnten zum Teil gefunden werden. Diese Arbeit zeigt die individuelle und kontrastreiche Wirksamkeit der Tannine auf. Sie unterstreicht, dass Tannine molekulare Regulatoren sind, welche nicht nur auf ihre antioxidative und antinutritive Kapazität reduziert werden sollten. / The polyphenolic tannins are plant-produced secondary metabolites with protein precipitating and binding capacities. This characteristic is seemingly responsible for antinutritional and harmful effects. However, health benefits have also been extensively described in the literature. Indeed, antioxidant properties are believed to be the reason for these beneficial effects. The established model organism Caenorhabditis elegans was chosen to examine this apparent contradiction. The nematodes were exposed to tannic acid and to the tannin building blocks gallic acid, ellagic acid, and catechin and the lifespan and stress resistance were determined. The presence of a calorie restriction (CR) effect and a hormetic dose-response-relationship was verified. Furthermore, antimicrobial and antioxidative capacities were assessed as possible causes of longevity and the impact on fitness parameters and gene expressions was analysed. The consideration of different ageing theories completed the analysis of the tannin action. All tannin-substances were able to prolong the lifespan but against all expectations, longevity and stress resistance were shown to be independent entities, which are not necessarily linked. Hormesis, CR-mimetic properties, antimicrobial capacities as well as several stress relevant genes are partly responsible for the life-extension. The antioxidant capacities, however, appeared to be irrelevant. The regulation of several hundred gene expressions by tannic acid underlined the complexity of the mode of action. Furthermore, the results partly confirm the “Disposable Soma Theory”, the “Mitohormesis Theory” and the “Green Theory of Ageing”. This work dissects the contrasting efficiency of the tannin family and underlines in particular, that tannins are molecular regulators, which should not be reduced to their antioxidative and antinutritional capacities

Die Anwendung von Birkenblättern (Betulae folium) erfolgt zur Durchspülung der Harnwege. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkungsweise der Birkenblätter auf verschiedenen Ebenen der Phytopharmakaforschung untersucht. Zunächst wurde in-vitro die Beeinflussung der Metallopeptidasen Neutrale Endopeptidase (NEP, EC 3.4.24.11), Angiotensin-Converting-Enzym (ACE, EC 3.4.15.1) und Leucin-Aminopeptidase (LAP, EC 3.4.11.2) durch Birkenblätterextrakte, -fraktionen und reine Naturstoffe untersucht. Die Auftrennung eines Methanol- und eines Ethylacetatextraktes führte nicht zur Gewinnung einzelner, für die Gesamtwirkungen der Extrakte verantwortlicher Fraktionen bzw. Komponenten. Die Eigenschaft der Flavonoide als wirksamkeitsmitbestimmende Inhaltsstoffe konnte jedoch bestätigt werden. Ein systematisches Screening von Flavonoiden ergab u.a., dass das Ausmaß der Enzymhemmung von der Anzahl der freien phenolischen OH-Funktionen bestimmt wurde und dass Flavonoidaglyka stärker die Enzyme hemmten, als die im Pflanzenmaterial vorliegenden Glykoside (IC50 NEP: Myricetin 42 Mikromol/L, Quercetin 192 Mikromol/L). Die in der Birkenrinde vorkommenden Triterpene Betulinsäure und Betulinol wurden als starke Inhibitoren der LAP erkannt (IC50 LAP: 7,3 +/- 1,4 bzw. 8,8 +/- 1,78 Mikromol/L). In einem nächsten Abschnitt der Arbeit wurden die Absorptionseigenschaften von Hyperosid und Rutin mit einem In-vitro-Perfusionsmodell am isolierten Rattendünndarm untersucht. Sowohl Rutin als auch Hyperosid traten unverändert als Glykoside durch den Darm in das Akzeptorkompartiment über. Auch in Form eines Birkenblätterextraktes wurde Hyperosid am Rattendünndarm absorbiert, der Extrakt veränderte jedoch nicht die Absorptionsrate. Als Mechanismus wurde der passive Transport durch die Poren der Tight junctions der Dünndarmzellen angenommen. Abschließend wurde eine Pilotstudie (n=14) durchgeführt, in der das ausgeschiedene Harnvolumen nach einmaliger Einnahme eines Birkenblättertees im Vergleich zu einer entsprechenden Menge Leitungswasser bestimmt wurde. Bei 50 % der Probanden wurde innerhalb der vierstündigen Testphase eine Zunahme der Harnproduktion beobachtet, bei den anderen 50 % stellte sich eine gegensätzliche Reaktion auf Tee und Placebo ein. Eine signifikante Erhöhung der Harnproduktion konnte somit, unter dem angegebenen Studiendesign, nicht nachgewiesen werden. / Irrigation of the urinary tract is the therapeutic indication for Birch leaf (Betulae folium). In the present thesis, effects and efficacy of Birch leaves were investigated in various fields of medicinal plant research. The effects of Birch leaf extracts, their fractions, and pure natural compounds on the metallopeptidases - Neutral Endopeptidase (NEP, EC 3.4.24.11), Angiotensin Converting Enzyme (ACE, EC 3.4.15.1), and Leucine Aminopeptidase (LAP, EC 3.4.11.2) - were investigated in vitro. Phytochemical separation of extracts obtained by methanol and ethyl acetate did not result in more active fractions compared to those of the whole extracts. The ability of flavonoids to contribute to the efficacy reached by Birch leaf extracts, could be confirmed. A systematic screening could show that the inhibitory potency of flavonoids is dependent on the number of phenolic hydroxyl functions in their chemical structure. Aglycones of flavonoids were more active than their corresponding glycosides occurring in the plant material (IC50 NEP: myricetin 42 mikromol/L, quercetin 192 mikromol/L). Betulinic acid and betulinol, triterpenes of the bark of Betula, inhibited LAP strongly by reaching an IC50 of 7,3 +/- 1,4 mikromol/L and 8,8 +/- 1,78 mikromol/L, respectively. Furthermore, this thesis showed the absorption profiles of hyperoside and rutin in an isolated small intestine model of the rat. Both glycosides were detected in the acceptor compartment without being metabolised. Administration of hyperoside by a Birch leaf extract did not influence the absorption rate. A passive transport through the pores of the tight junctions, localized between the intestinal cells, was considered to be the mechanism of absorption of the flavonol glycosides. Finally, a human pilot study (n=14) was carried out. The excreted urinary volume was determined after a single intake of a Birch leaf infusion or tap water. An increased urine output after 4 hours of the test period was found in 50% of the volunteers. In the contrary, an opposite effect was determined in 50% of the volunteers after administration of the herbal infusion and of a placebo solution. Thus, no significant increase of urine volume could be observed under these test conditions.

Objectives: Antiadherent and antibacterial effects of certain plant extracts have been proven to be beneficial in preventive dentistry. In the present in situ/in vitro crossover study, the impact of plant extracts rich in polyphenols on the erosion-protective properties of the in situ pellicle was evaluated. Methods: Individual splints were prepared for 12 subjects for intraoral exposure of bovine enamel specimens. Following formation of a 1-min pellicle, watery plant extracts(leaves of the wild form of Ribes nigrum , the wild form of Origanum as well as a combination of both) were administered for 10 min in situ. Alternatively, a mouth rinse with fluorides (Elmex Kariesschutz) was performed for 1 min. After further oral exposure for 19/28 min, respectively, slabs were removed and incubated with HCl in vitro over 120 s (pH 2, 2.3, 3). The resulting calcium and phosphate release was quantified photometrically. Slabs with and without a 30-min in situ pellicle served as controls. The modification of pellicle ultrastructure was evaluated by transmission electron microscopy (TEM). Results: Plant extracts modulated the erosion-protective properties of the native in situ pellicle in all test groups in a pH-dependent manner. The combination of R. nigrum leaves and Origanum enhanced the protective properties of the pellicle at all pH values; the administration of this preparation was comparable, yet superior, to the effect of the fluoridated mouth rinse. TEM images indicated that rinsing with R. nigrum leaves /Origanum yielded a distinctly thicker and more electron-dense pellicle. Conclusion: The combination of certain plant extracts offers a novel approach to the complementary prevention of dental erosion.