Orientador: Elias Basile Tambourgi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:25:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_PetrusPires_D.pdf: 42672280 bytes, checksum: 577c0450f1a36f0daf1a38e8fcbdd55f (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O presente trabalho teve como objeto de estudo uma fosfolipase A2 (PLA2) isolada do veneno de serpente endêmica do noroeste da América do Sul, Porthidium hyoprora. Nomeada PhTX­III, a proteína foi purificada do veneno da serpente através de duas etapas cromatográficas (gel filtração e HPLC em fase reversa) revelando-­se uma PLA2 ácida, um tipo menos comum de fosfolipase. Verificou-­se homologia entre PhTX-III e PLA2 de venenos de outras serpentes, através de experimentos de espectrometria de massas. Além disso, foi possível a observação de áreas conservadas dessas fosfolipase, como o sítio ativo e alça de ligação ao cálcio, com alterações pontuais de alguns resíduos, quando compara-se com outras PLA2 semelhantes. PhTX­III teve massa molecular exata confirmada, por experimentos de espectrometria de massas, de 13620,9 Da, pH e temperatura ótimos de 8,0 e 37°C, respectivamente. A enzima apresentou Km 4,43 mM e VMáx 10,81 U. A necessidade de íons Ca2+ para manutenção da atividade catalítica foi confirmada experimentalmente, e sua substituição por outros íons bivalentes leva à redução de poder catalítico ou até mesmo supressão total, como no caso do íon Zn2+. Assim como diversas PLA2 ácidas já descritas, PhTX-III não apresenta alguns dos mais clássicos efeitos farmacológicos para essa classe de enzimas, como miotoxicidade local, miotoxicidade sistêmica, ação anticoagulante ou antibacteriana. No entanto, uma aguda reação inflamatória pode ser observada após sua injeção, pela elevada liberação de citocinas pró-­inflamatórias IL-1?, IL-6 e TNF-? e observação de efeito edematogênico moderado. Análises morfológicas de tecido muscular de camundongo afetado pela ação da PhTX-III demonstraram a integridade do tecido com relação à dano muscular, confirmando a ausência de ação miotóxica. Foi possível observar, no entanto, a presença de infiltrado inflamatório com alta concentração de células. O uso de técnica de coloração de Dominici, específica para células da série branca do sangue, permitiu a identificação dessas células como mastócitos. Essas informações levam a acreditar que PhTX-III ocasiona uma sequencia de reações que culminam com degranulação de mastócitos, responsáveis pela liberação das citocinas inflamatórias detectadas. As características estruturais e funcionais obtidas nesse trabalho podem levar à futuras descobertas mais detalhadas sobre o funcionamento das PLA2, -­ ajudando a elucidar as relações ainda não totalmente claras entre estrutura e função dessas proteínas / Abstract: The object of study in the present work is a phospholipase A2 isolated from the venom of a South American endemic snake, Porthidium hyoprora, named PhTX-III. The protein was purified from the crude venom through two sequential chromatographic steps (gel filtration and reverse phase HPLC) and was classified as an acidic PLA2, a less common type, presenting homology with other proteins of that kind, as identified by its primary sequence analysis in mass spectrometry. The comparative analysis of the peptides obtained after PhTX-III digestion revealed not only a high identity with other acidic PLA2 but also allowed the identification of several conserved areas of these phospholipases, such as the active site and the calcium binding loop. It is also possible to observe punctual alterations in some residues when comparing it to other similar PLA2. PhTX-III had its exact molecular mass confirmed by mass spectrometry as 13620,9 Da, optimal pH and temperature of 8.0 and 3.7°C respectively. The enzyme presented Km of 4.43 mM and VmaxA of 10,81 U. The need of Ca2+ ions to maintain activity was confirmed experimentally and its substitution by other divalent ions leads to catalytic power reduction, or its total suppression, as in the case of Zn2+. PhTX-III, as well as several other PLA2 already described, doesn't present some of the most classical pharmacological effects for this class of enzymes, like local myotoxicity, systemic myotoxicity, anti-­coagulant effect of anti-­bacterial effect. Nonetheless an intense inflammatory reaction can be observed after PhTX-III injection, through an elevated pro-­inflammatory cytokine release, with high levels of IL­1?, IL-6 and TNF-?. Also it was possible to observe a moderate edematogenic effect. Morphological analysis of mice muscle injected with PhTX-III demonstrated integrity of the tissue, with no muscle damage, reassuring the previous results of the myotoxicity tests. It was possible to observe, though, the presence of inflammatory infiltrate with high concentration of cells. The use of Dominici's staining technique, specific for blood white cells, allowed the identification of these as mast cells. This information led the researcher to believe PhTX-III causes a sequence of reactions culminating in mas cell degranulation, responsible for the release of the cytokines detected. The structural and functional characteristics obtained in this work can lead to future discoveries about the PLA2 function, helping to unveil the not yet clear relationship between structure and function in this class of proteins / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:14:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vega_SalomonHuancahuire_D.pdf: 1506157 bytes, checksum: 874bfba78d521b4e037ba15f754d80b7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: No presente trabalho, a partir do veneno de Porthidium hyoprora, foram purificadas duas fosfolipases A2 (PLA2) miotóxicas, denominadas PhTX-I e PhTX-II, determinadas suas sequências primárias e caracterizadas bioquímica e farmacologicamente. Ambas as proteínas foram purificadas em uma única etapa cromatográfica (HPLC-FR), sendo obtida homogênea e com alto grau de pureza, confirmado por SDS-PAGE, análise de aminoácidos e espectrometria de massas. PhTX-I e PhTX-II estão constituídas de uma única cadeia polipeptídica e possuem massas moleculares de 14.249 e 14.149 Da, respectivamente. A sequência de aminoácidos foi determinada via espectrometria de massas ESI-MS/MS, pertencendo à família das PLA2 D49. A estrutura secundária predominante destas proteínas está constituída de ?-hélices. PhTX-I e PhTX-II induziram atividade paralisante neuromuscular ex vivo na preparação de biventer cervicis de pintainho e esta atividade foi similar ao efeito de outras PLA2 de veneno botrópico. In vivo, tanto PhTX-I quanto PhTX-II, induziram elevada miotoxicidade local e atividade edematogênica. Adicionalmente, PhTX-I induz liberação de IL-6 após injeção intramuscular em camundongos. In vitro, PhTX-I e PhTX-II foram citotóxicas de maneira dose-dependente para as linhagens celulares de fibroblastos NIH-3T3 e NG97 derivada de astrocitoma humano grau III. Adicionalmente PhTX-I foi citotóxica sobre cultura celular de miotubos C2C12, entretanto teve pouco efeito citolítico sobre mioblastos de músculo esquelético. Foram feitas modificações químicas em resíduos de aminoácidos específicos da PhTX-I e avaliadas suas atividades farmacológicas após as modificações. Foram modificados um resíduo de His e Trp, quatro de Tyr e sete de Lys. A análise destas proteínas por dicroísmo circular demonstrou que a estrutura secundária das proteínas modificadas não foi alterada significantemente. Avaliação das atividades biológicas indicam um papel crítico desempenhado pelos aminoácidos Lys e Tyr na miotoxicidade, efeito paralisante neuromuscular e principalmente na citotoxicidade induzida por PhTX-I. A atividade catalítica da PhTX-I é relevante para os efeitos edematogênico, paralisante neuromuscular e miotóxico, mas não para sua atividade citotóxica, pois este efeito foi completamente independente da atividade catalítica de PhTX-I, evidenciando a existência de regiões moleculares, diferentes a do sítio catalítico, as quais podem ser responsáveis por pelo menos algumas das propriedades farmacológicas da PhTX-I. Podemos concluir, que apesar de ser demonstrada uma dissociação parcial, tanto o sítio catalítico como os sítios farmacológicos hipotéticos são relevantes para o perfil farmacológico de PhTX-I / Abstract: In this work, were purified two myotoxics phospholipases A2 (PLA2), PhTX-I and PhTX-II, from P. hyoprora snake venom, determined their primary sequences and characterized their pharmacological and biochemical activities. These proteins were purified in a single chromatographic step (FR-HPLC) and obtained with homogeneous and high purity, which was confirmed by SDS-PAGE, amino acid analysis and mass spectrometry. PhTX-I and PhTX-II are constituted of a single polipetide chain and have molecular mass of 14.249 and 14.149 Da, respectively. The amino acid sequence was determined by ESI-MS/MS mass spectrometry; belong to PLA2 D49 family. The predominant secondary structure of these proteins consists of ?-helix. PhTX-I and PhTX-II induced neuromuscular paralyzing effect ex vivo in young chick biventer cervicis preparations, this activity was similar to other PLA2 of snake venom. In vivo, PhTX-I and PhTX -II induced local myotoxicity and edema-forming activity, in addition, PhTX-I induces release of IL-6 after intramuscular injection in mice. In vitro, PhTX-I and PhTX -II were cytotoxic to the fibroblast cell line NIH-3T3 and NG97 derived from grade III human astrocytoma. Additionally PhTX-I induced low cytotoxicity in skeletal muscle myoblasts, however was able to lyse myotubes. Were made modifications chemical in PhTX-I specific amino acid residues and evaluated the pharmacological activities after modifications. Was modified one His and Trp, four Tyr and seven Lys residues? Analysis by circular dichroism demonstrated that secondary structure of protein remains practically unchanged. Evaluation of biological activities indicate a critical role of Lys and Tyr amino acid at myotoxicity, neuromuscular paralyzing effect, and especially cytotoxicity induced by PhTX-I. The catalytic activity of PhTX-I is relevant to the edematogenic, neuromuscular paralyzing and myotoxic effects, but not for their cytotoxic activity, since this effect is completely independent of the catalytic activity of PhTX-I, demonstrating the existence of molecular regions, different from the catalytic site, which may be responsible for at least some of the pharmacological properties of PhTX-I. We conclude that both the catalytic site and the hypothetical pharmacological site(s) are apparently relevant for the pharmacological profile of PhTX-I, although a partial dissociation between these activities has been demonstrated / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular