In the field of postmortem toxicology, principles from pharmacology and toxicology are combined in order to determine if exogenous substances contributed to ones death. In order to make this determination postmortem and (whenever available) antemortem blood samples may be analyzed. This project focused on evaluating the relationship between postmortem and antemortem blood drug levels, in order to better define an interpretive framework for postmortem toxicology. To do this, it was imperative to evaluate the differences in antemortem and postmortem drug concentrations, determine the role microbial activity and evaluate drug stability. Microbial studies determined that the bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa could use the carbon structures of drugs as a source of food. This would suggest prior to sample collection, microbial activity could potentially affect drug levels. This process however would stop before toxicologic evaluation, as at autopsy blood samples are stored in tubes containing the antimicrobial agent sodium fluoride. Analysis of preserved blood determined that under the current storage conditions sodium fluoride effectively inhibited microbial growth. Nonetheless, in many instances inconsistent drug concentrations were identified. When comparing antemortem to postmortem results, diphenhydramine, morphine, codeine and methadone, all showed significantly increased postmortem drug levels. In many instances, increased postmortem concentrations correlated with extended postmortem intervals. Other drugs, such as alprazolam, were likely to have concentration discrepancies when short antemortem to death intervals were coupled with extended postmortem intervals. While still others, such as midazolam followed the expected pattern of metabolism and elimination, which often resulted in decreased postmortem concentrations. The importance of drug stability was displayed when reviewing the clonazepam/ 7-aminoclonazepam data, as the parent drug commonly converted to its metabolite even when stored in the presence of a preservative. In instances of decreasing postmortem drug concentrations the effect of refrigerated storage could not be ruled out. A stability experiment, which contained codeine, produced data that indicated concentrations could continue to decline under the current storage conditions. The cumulative data gathered for this experiment was used to identify concentration trends, which subsequently aided in the development of interpretive considerations for the specific analytes examined in the study.

Os barbitúricos são fármacos com atividade depressora do sistema nervoso central e estão relacionados com elevados números de casos de intoxicações e uso não-médico em vários países. No Brasil, a droga antiepiléptica mais encontrada em casos de intoxicação é o fenobarbital, pois os pacientes relatam que \"essa é uma substância com ação forte no cérebro\". De fato, os barbitúricos estão altamente relacionados com tentativa de suicídio e homicídio. Nesses casos existe a necessidade da quantificação dessas substâncias para correlacionar com a causa mortis. No entanto, as análises toxicológicas postmortem são de difícil execução e interpretação, pois a concentração de agentes tóxicos encontrados é bastante complexa e afetada não só pela condição de deterioração do corpo, mas também por um processo conhecido como redistribuição postmortem. Em geral, concentrações mais elevadas são encontradas no sangue situado nos sítios centrais (como o sangue coletado da cavidade cardíaca) em comparação aos níveis verificados nos vasos periféricos (como a veia femoral). Em outros casos, o tempo entre a morte e o exame postmortem é suficiente para que algumas substâncias que normalmente estariam presentes no sangue não estejam mais disponíveis neste fluido biológico. Há ainda um agravante, pois não existem valores de referências para a maioria das amostras biológicas não-convencionais, dificultando assim a interpretação dos resultados. Os exames toxicológicos devem ser realizados em amostras biológicas e tem como objetivo a avaliação da intoxicação como circunstância qualificadora do delito, como causa de periculosidade ou imputabilidade. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e aplicação de métodos de identificação de barbitúricos (butalbital, secobarbital, pentobarbital e fenobarbital) em amostras postmortem (sangue cardíaco, sangue femoral e fígado). Os analitos foram extraídos das amostras utilizando a micro extração em fase líquida (LPME), identificados e quantificados por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Após o desenvolvimento e validação, os métodos analíticos foram aplicados em amostras postmortem de onze cadáveres necropsiados pelo Serviço de Verificação de Óbito da Cidade de São Paulo (SVO (SVO-USP), com suspeita de envolvimento de barbitúricos. Nove casos apresentaram resultado positivo para fenobarbital. A média da razão sangue femoral/sangue cardíaco foi de 0,91 com o desvio padrão de 0,23. Para a correlação fígado/sangue femoral a média foi de 1,17 com desvio padrão de 1,29. Os barbitúricos foram escolhidos como modelo de estudo devido à grande incidência de casos de intoxicação aguda com estes fármacos no Brasil. / Barbiturates are a class of drugs that act as central nervous system depressant and are associated with high numbers of poisoning cases and non-medical use in several countries. In Brazil, phenobarbital is the most related antiepileptic drug involved in intoxication cases. Patients report that \"this drug is a substance with strong action in the brain.\" In fact, barbiturates are highly related to attempted suicide and homicide cases, in which quantification of these substances to correlate with the possible cause of death is necessary. However, postmortem toxicological analyses are difficult to perform and interpret, because the concentration of toxic agents found is quite complex and affected not only by deterioration condition of the body but also by a process known as postmortem redistribution. In general, higher concentrations are found in the blood located in central sites (e.g. heart cavity) compared with the levels found in peripheral vessels (such as the femoral vein). In other cases, the time between death and postmortem examination is enough for some substances that would normally be present in the blood are no longer available in this biological fluid. Besides, there are few reference values for most non-conventional biological samples, making it difficult to interpret the results. The objective of this work was the development and application of methods for identification of barbiturates (butalbital, secobarbital, pentobarbital and phenobarbital) in postmortem samples (heart blood, femoral blood and liver). The analytes were extracted by using liquid-phase micro extraction (LPME) and quantified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). After the development and validation, analytical methods were applied in real cases of eleven corpses autopsied by Death Verification Service of São Paulo City (USP-SVO), with suspected of barbiturates involvement. Nine cases were positive for phenobarbital. The mean ratio of blood femoral / cardiac blood was 0.91 with a standard deviation of 0.23. For the correlation liver / femoral blood the average was 1.17 with a standard deviation of 1.29. Barbiturates were chosen as model for this study because the high incidence of cases of acute poisoning with these drugs in Brazil.

Os barbitúricos são fármacos com atividade depressora do sistema nervoso central e estão relacionados com elevados números de casos de intoxicações e uso não-médico em vários países. No Brasil, a droga antiepiléptica mais encontrada em casos de intoxicação é o fenobarbital, pois os pacientes relatam que \"essa é uma substância com ação forte no cérebro\". De fato, os barbitúricos estão altamente relacionados com tentativa de suicídio e homicídio. Nesses casos existe a necessidade da quantificação dessas substâncias para correlacionar com a causa mortis. No entanto, as análises toxicológicas postmortem são de difícil execução e interpretação, pois a concentração de agentes tóxicos encontrados é bastante complexa e afetada não só pela condição de deterioração do corpo, mas também por um processo conhecido como redistribuição postmortem. Em geral, concentrações mais elevadas são encontradas no sangue situado nos sítios centrais (como o sangue coletado da cavidade cardíaca) em comparação aos níveis verificados nos vasos periféricos (como a veia femoral). Em outros casos, o tempo entre a morte e o exame postmortem é suficiente para que algumas substâncias que normalmente estariam presentes no sangue não estejam mais disponíveis neste fluido biológico. Há ainda um agravante, pois não existem valores de referências para a maioria das amostras biológicas não-convencionais, dificultando assim a interpretação dos resultados. Os exames toxicológicos devem ser realizados em amostras biológicas e tem como objetivo a avaliação da intoxicação como circunstância qualificadora do delito, como causa de periculosidade ou imputabilidade. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e aplicação de métodos de identificação de barbitúricos (butalbital, secobarbital, pentobarbital e fenobarbital) em amostras postmortem (sangue cardíaco, sangue femoral e fígado). Os analitos foram extraídos das amostras utilizando a micro extração em fase líquida (LPME), identificados e quantificados por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Após o desenvolvimento e validação, os métodos analíticos foram aplicados em amostras postmortem de onze cadáveres necropsiados pelo Serviço de Verificação de Óbito da Cidade de São Paulo (SVO (SVO-USP), com suspeita de envolvimento de barbitúricos. Nove casos apresentaram resultado positivo para fenobarbital. A média da razão sangue femoral/sangue cardíaco foi de 0,91 com o desvio padrão de 0,23. Para a correlação fígado/sangue femoral a média foi de 1,17 com desvio padrão de 1,29. Os barbitúricos foram escolhidos como modelo de estudo devido à grande incidência de casos de intoxicação aguda com estes fármacos no Brasil. / Barbiturates are a class of drugs that act as central nervous system depressant and are associated with high numbers of poisoning cases and non-medical use in several countries. In Brazil, phenobarbital is the most related antiepileptic drug involved in intoxication cases. Patients report that \"this drug is a substance with strong action in the brain.\" In fact, barbiturates are highly related to attempted suicide and homicide cases, in which quantification of these substances to correlate with the possible cause of death is necessary. However, postmortem toxicological analyses are difficult to perform and interpret, because the concentration of toxic agents found is quite complex and affected not only by deterioration condition of the body but also by a process known as postmortem redistribution. In general, higher concentrations are found in the blood located in central sites (e.g. heart cavity) compared with the levels found in peripheral vessels (such as the femoral vein). In other cases, the time between death and postmortem examination is enough for some substances that would normally be present in the blood are no longer available in this biological fluid. Besides, there are few reference values for most non-conventional biological samples, making it difficult to interpret the results. The objective of this work was the development and application of methods for identification of barbiturates (butalbital, secobarbital, pentobarbital and phenobarbital) in postmortem samples (heart blood, femoral blood and liver). The analytes were extracted by using liquid-phase micro extraction (LPME) and quantified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). After the development and validation, analytical methods were applied in real cases of eleven corpses autopsied by Death Verification Service of São Paulo City (USP-SVO), with suspected of barbiturates involvement. Nine cases were positive for phenobarbital. The mean ratio of blood femoral / cardiac blood was 0.91 with a standard deviation of 0.23. For the correlation liver / femoral blood the average was 1.17 with a standard deviation of 1.29. Barbiturates were chosen as model for this study because the high incidence of cases of acute poisoning with these drugs in Brazil.

O uso abusivo de substâncias psicoativas cresce a cada dia em diferentes segmentos da sociedade mundialmente. Aumentos significativos no número de ocorrências de óbito com envolvimento de tais substâncias têm sido reportados nas últimas décadas. A classe dos opiáceos está figurada entre as substâncias de maior prevalência nesse contexto. Em toxicologia forense, análises toxicológicas conduzidas em amostras postmortem podem auxiliar se substâncias químicas tiveram influência no óbito. A realização dessas análises e interpretação dos resultados obtidos nesses casos é bastante complexa devido à deterioração sofrida pelos cadáveres, e também pela ocorrência de um fenômeno denominado redistribuição postmortem, responsável pela transferência de substâncias após a morte a favor de gradiente de concentração. Em geral, as substâncias são transferidas de órgãos como fígado, coração, pulmões, e trato gastrointestinal, para locais de menor concentração, afetando principalmente o sangue da região central e órgãos adjacentes. O humor vítreo, apesar de considerado um espécime não-convencional, pode ser bastante útil, principalmente em casos onde não há amostras sanguíneas disponíveis para coleta. Esse espécime se apresenta como uma matriz menos propensa à decomposição bacteriana, além de ser menos afetado pela redistribuição postmortem por sua localização mais afastada dos sítios centrais. Desta forma, um método para quantificação de opiáceos (morfina livre e total, codeína e 6-acetilmorfina) em sangue (cardíaco e periférico) e em humor vítreo humanos coletados postmortem foi desenvolvido e validado. O método mostrou ser preciso, eficiente e sensível, com limite de quantificação de 10 ng/ml. Amostras de 7 casos postmortem com envolvimento de opiáceos foram analisadas com o intuito de verificar correlação nas concentrações entre os sítios, e possível ocorrência do fenômeno de redistribuição. / The abuse of psychoactive substances grows every day worldwide in different segments of the society. Significant increases in the number of drug-related deaths have been reported in recent decades. The class of opiates is one of the most prevalent substances in this context. In forensic toxicology, toxicological analyses are performed in postmortem samples to evaluate whether chemical substances were involved in the death. The completion of this analysis and interpretation of results are very complex due to the deterioration suffered by the corpses, and also by the occurrence of the phenomenon called postmortem redistribution, responsible for the transfer of substances along a concentration gradient after death. In general, the transference of the substances occurred from organs such as liver, heart, lungs and gastrointestinal tract to sites of low concentrations, mainly affecting the blood from central sites and adjacent organs. By this reason, the collection of blood from two different sites of the body for comparison is highly recommendable. Despite being considered a non-conventional specimen, vitreous humor can be quite useful, especially in cases where no blood samples are available for collection. This specimen is usually less prone to bacterial decomposition, and it\'s also less affected by postmortem redistribution due to its location further away from central sites. Thus, a method to quantify opiates (free and total morphine, codeine and 6- monoacetylmorphine) in postmortem blood (cardiac and peripheral) and in vitreous humor samples was developed and validated. The method showed good accuracy, efficiency and sensibility, with limit of quantification of the 10 ng/ml. Seven samples of postmortem cases with opiates involvement were analyzed to verify the correlation in the concentrations of the sites, and possible occurrence of the redistribution phenomenon.

O uso abusivo de substâncias psicoativas cresce a cada dia em diferentes segmentos da sociedade mundialmente. Aumentos significativos no número de ocorrências de óbito com envolvimento de tais substâncias têm sido reportados nas últimas décadas. A classe dos opiáceos está figurada entre as substâncias de maior prevalência nesse contexto. Em toxicologia forense, análises toxicológicas conduzidas em amostras postmortem podem auxiliar se substâncias químicas tiveram influência no óbito. A realização dessas análises e interpretação dos resultados obtidos nesses casos é bastante complexa devido à deterioração sofrida pelos cadáveres, e também pela ocorrência de um fenômeno denominado redistribuição postmortem, responsável pela transferência de substâncias após a morte a favor de gradiente de concentração. Em geral, as substâncias são transferidas de órgãos como fígado, coração, pulmões, e trato gastrointestinal, para locais de menor concentração, afetando principalmente o sangue da região central e órgãos adjacentes. O humor vítreo, apesar de considerado um espécime não-convencional, pode ser bastante útil, principalmente em casos onde não há amostras sanguíneas disponíveis para coleta. Esse espécime se apresenta como uma matriz menos propensa à decomposição bacteriana, além de ser menos afetado pela redistribuição postmortem por sua localização mais afastada dos sítios centrais. Desta forma, um método para quantificação de opiáceos (morfina livre e total, codeína e 6-acetilmorfina) em sangue (cardíaco e periférico) e em humor vítreo humanos coletados postmortem foi desenvolvido e validado. O método mostrou ser preciso, eficiente e sensível, com limite de quantificação de 10 ng/ml. Amostras de 7 casos postmortem com envolvimento de opiáceos foram analisadas com o intuito de verificar correlação nas concentrações entre os sítios, e possível ocorrência do fenômeno de redistribuição. / The abuse of psychoactive substances grows every day worldwide in different segments of the society. Significant increases in the number of drug-related deaths have been reported in recent decades. The class of opiates is one of the most prevalent substances in this context. In forensic toxicology, toxicological analyses are performed in postmortem samples to evaluate whether chemical substances were involved in the death. The completion of this analysis and interpretation of results are very complex due to the deterioration suffered by the corpses, and also by the occurrence of the phenomenon called postmortem redistribution, responsible for the transfer of substances along a concentration gradient after death. In general, the transference of the substances occurred from organs such as liver, heart, lungs and gastrointestinal tract to sites of low concentrations, mainly affecting the blood from central sites and adjacent organs. By this reason, the collection of blood from two different sites of the body for comparison is highly recommendable. Despite being considered a non-conventional specimen, vitreous humor can be quite useful, especially in cases where no blood samples are available for collection. This specimen is usually less prone to bacterial decomposition, and it\'s also less affected by postmortem redistribution due to its location further away from central sites. Thus, a method to quantify opiates (free and total morphine, codeine and 6- monoacetylmorphine) in postmortem blood (cardiac and peripheral) and in vitreous humor samples was developed and validated. The method showed good accuracy, efficiency and sensibility, with limit of quantification of the 10 ng/ml. Seven samples of postmortem cases with opiates involvement were analyzed to verify the correlation in the concentrations of the sites, and possible occurrence of the redistribution phenomenon.