Les malalties que causen ceguesa total o parcial afecten a milions de persones arreu del món. Una de les principals causas de ceguesa és el glaucoma, malaltia caracteritzada per un augment de la pressió intraocular (IOP) i una pèrdua de visió perifèrica. La fisiopatologia del glaucoma està estretament relacionada amb la fisiologia de l'humor aquós, fluid contingut a les cambres oculars (anterior i posterior). Des de la cambra anterior, l'humor aquós s'eliminarà a través de: 1) la via uveoescleral, que és minoritària, i 2) la via convencional o trabecular, on la major part de l'humor aquós (aprox. 80%) s'elimina travessant la xarxa trabecular cap el canal d'Schlemm i les venes aquoses. L'humor aquós té dues funcions: 1) nodrir les estructures avasculars (còrnia i cristal·lí) i 2) mantenir la IOP dins dels marges fisiològics (15-16 mmHg). Quan s'altera l'equilibri entre la producció i l'evacuació de l'humor aquós, l'humor aquós s'acumula i la IOP augmenta. La xarxa trabecular és un teixit d'estructura similar a una esponja organitzat en diferents regions i en contacte directe amb el canal d'Schlemm. La part més propera al canal d'Schlemm és la que presenta major resistència al pas de l'humor aquós. Alteracions en aquesta via suposaran un augment de la resistència i, en conseqüència, un augment de la IOP. La contractilitat cel·lular i la regulació del volum de la cèl·lula trabecular, són dos mecanismes claus en la regulació de la permeabilitat de la xarxa trabecular. Aquests dos mecanismes induirien deformacions a la membrana que activarien canals mecanosensibles.Un d'aquests canals mecanosensibles és el canal de K+ d'alta conductància dependent de Ca2+ (BKCa), que es caracteritza per la seva activació per voltatges despolaritzants i està modulat pel calci intracel·lula i del qual s'ha demostrat la seva mecanosensibilitat en diferents teixits.Per aquesta raó, s'ha caracteritzat electrofisiològicament el canal BKCa a la cèl·lula trabecular i s'ha estudiat la seva modulació per diferents factors, entre ells l'stretch mecànic. El canal BKCa ha demostrat ésser mecanosensible augmentant la seva probabilitat d'obertura tant per canvis en la tensió de la membrana cel·lular com per increments del volum cel·lular (swelling). En altres sistemes el canal està modulat per la pressió parcial d'oxigen (PO2), de manera que estímuls hipòxics disminueixen l'activitat del canal produïnt despolaritzacions com en les cèl·lules del cos carotidi. A l'ull, l'humor aquós aporta oxigen a les estructures avasculars i a la xarxa trabecular. Els valors de PO2 de l'humor aquós són més baixos (aprox. 55 mmHg) que en altres teixits més oxigenats (aprox. 95 mmHg). Per aquesta raó qualsevol procés que produeixi hipòxia a la cambra anterior tindrà un efecte més acusat. Per aquests motius s'ha estudiat quins mecanismes poden existir a les cèl·lules trabeculars per respondre a estats hipòxics. Els resultats obtinguts mostren com els corrents mitjançats pel canal BKCa disminueixen quan les cèl·lules trabeculars es tracten amb una solució hipòxica. Aquesta disminució dels corrents totals també s'observa en cèl·lules incubades en condicions d'hipòxia (5% O2).La hipòxia produeix alteracions a la mobilització del calci intracel·lular ([Ca2+]i) en diferents tipus cel·lulars. A les cèl·lules trabeculars s'ha estudiat l'efecte de la hipòxia sobre la [Ca2+]i i s'ha observat com la hipòxia modifica la resposta en relació al [Ca2+]i quan s'apliquen diferents substàncies vasoactives (bradikinina, endotel·lina-1) que influeixen sobre l'evacuació de l'humor aquós i que augmenten la [Ca2+]i a la cèl·lula trabecular. La hipòxia produeix entre d'altres efectes, un augment de la [Ca2+]i basal respecte les cèl·lules control (normòxiques) i disminueix l'increment de la [Ca2+]i produït per les substàncies agonistes. / SUBJECT: Electrophysiological characterization of a large conductance Ca2+-activated K+ channel (BKCa) in trabecular meshwork cells: modulation by membrane stretch and hypoxiaTEXT: The understanding of the physiology of the trabecular meshwork has advanced in the last few years, however few ionic channels have been characterized in this tissue. The large conductance Ca2+-activated K+ channel (BKCa) has been identified in the trabecular meshwork cells but its function is still unknown. BKCa channel is voltage dependent and its activity is modulated by intracellular calcium concentration ([Ca2+]i), with different functions depending on the cell type. In excitable cells it controls neuronal excitability, participates in neurotransmitter release and modulates contractile tone in vascular smooth muscle. In non-excitable cells it has been described its participation in cell volume regulation and its modulatory effect on different substances that mobilize [Ca2+]i.Besides [Ca2+]I, other substances such as cGMP or nitric oxide modulate the activity of BKCa channel in the trabecular meshwork. In other tissues, BKCa channel has shown mechanosensitive properties and it has also been described how its activity is modified by low PO2 values (hypoxia). Since trabecular meshwork cells are subjected to intraocular pressure and that aqueous humor contained in the anterior chamber presents PO2 values lower than other tissues, it is important to study the effects of these modulators on BKCa channel activity which will have a direct effect on the physiology of the trabecular meshwork.

El glaucoma es una de las principales causas de ceguera parcial o total e irreversible en el mundo. Los avances en su estudio revelan la compleja naturaleza multifactorial de la enfermedad que consiste finalmente en un daño del nervio óptico (neuropatía).El incremento de la presión intraocular (PIO) prolongado en el tiempo es uno de los factores de riesgo más significativo y reconocido para el desarrollo de esta enfermedad. Este incremento puede causar lesiones en el nervio óptico por deformación mecánica y/o cambios fisiopatológicos en una zona de la retina dónde se sitúan las células ganglionares del nervio. La PIO es resultado del balance entre la producción y drenaje del humor acuoso. El humor acuoso es un fluído derivado de plasma sanguíneo, producido en los procesos ciliares, que baña la cámara anterior del ojo para alimentar sus estructuras avasculares y mantener la tensión mecánica adecuada del globo ocular, y es drenado, principalmente, a través de la malla trabecular o trabéculo. Se sabe que el incremento de la contracción de este tejido implica una disminución en la facilidad de drenaje del humor acuoso y un aumento de la PIO. La presencia incrementada de endotelina-1 (ET-1), potente vasoconstrictor, en humor acuoso de pacientes glaucomatosos plantea algunas cuestiones que abordamos en este trabajo de tesis doctoral. Estas sustancias (endotelina-1, bradiquinina) son agonistas de receptores acoplados a proteína Gq que activan la vía de la fosfolipasa C (vía PLC- inositol trifosfato y diacilglicerol) y podrían tener un efecto contráctil, también, sobre la malla trabecular dado que activan la depleción de Ca2+ intracelular. El objetivo principal de este trabajo de tesis doctoral ha sido identificar y caracterizar un tipo de corriente de entrada de calcio extracelular (vía principal de entrada de calcio en células no excitables), llamada corriente 'capacitativa' de Ca2+ o dependiente del vaciado de Ca2+ de los depósitos intracelulares (ICCE o ISOC) y su posible implicación en la función de contracción/relajación de las células trabeculares y en consecuencia del tejido. Identificamos distintos tipos de corrientes capacitativas de Ca2+ en cultivos primarios de células trabeculares en modelo bovino y humano, tras el estímulo con sustancias vasoconstrictoras y tapsigargina. Para la caracterización farmacológica usamos bloqueadores típicos de la ICCE (2-APB, lantánidos, SKF96365) y registramos la evolución de la activación de ICCE mediante registros electrofisiológicos, testeando nuevamente bloqueadores conocidos de este tipo de corrientes. Observamos cómo en algunos casos las corrientes capacitativas son selectivas para el Ca2+ y en otros (vía PLC), en cambio, aparecían formas de corrientes catiónicas no selectivas.Detectamos mediante western blot la presencia de proteínas de canal tipo TRPC (TRPC1 y TRPC4) que forman canales catiónicos en membrana y pueden ser activados vía PLC, posibles mediadores de la ICCE en células trabeculares.La técnica de microscopía de tracción permitió estudiar la evolución de la contracción de la célula por estímulo con sustancias vasoconstrictoras. Obtuvimos medidas cuantitativas y la distribución de fuerzas en la célula durante la contracción. Estos resultados revelaron que la contracción inducida por estas sustancias depende primeramente de la depleción de Ca2+ intracelular y curiosamente, el Ca2+ extracelular regula, disminuyendo, la intensidad de esa contracción. Mostramos en este trabajo, la existencia de la ICCE en células trabeculares y sugerimos el papel de esta vía de entrada de Ca2+ como señal autoreguladora del proceso de contracción celular y su posible efecto en la función evacuadora del tejido. / High concentrations of endothelin-1 (ET-1), one of the most potent vasoconstrictor peptide, has been found in the aqueous humor of glaucomatous eyes. It is said that vasoconstrictor substances as ET-1 or bradykinin could induce contraction of trabecular meshwork tissue (TM) and decreases the aqueous humour outflow facility increasing the intraocular pessure (IOP) and the risk of glaucoma. The aim of this study is the calcium signalling, mainly, the characterization of the calcium influx/entry in these cells, the identification of capacitative calcium entry (ICCE) or, also called, store-operated calcium entry (ISOC) in trabecular cells and their role on cell contraction.We found these currents in cell culture of bovine and human trabecular cells and in a human cell line, too, using fluorescence techniques and electrophysiology recordings. They are stimulated by the intracellular Ca2+ depletion from stores via IP3 (bradykinin, endothelin) and blocking the Ca2+-pump of endoplasmic reticulum (thapsigargin). These currents are blocked or inhibited by certain lanthanids ions, 2-APB or SKF96365. Western blots showed the presence of certain members of the Transient Receptor Potential (TRP) channels subfamily C (TRPC1 and TRPC4). The pharmacology of inhibition of the Ca2+ influx suggests the TRPC channels and store-operated calcium channels as mediators. The measurements of cell traction evolution by traction microscopy maps stimulating with vasoconstrictor substances were useful to determine store-operated Ca2+ entry may not be necessary for cell contraction in TM cells but may contribute to modulate cell contractility and so, the aqueous humour outflow facility.