Die primäre Nebennierenrinden-Insuffizienz ist ein potenziell lebensbedrohliches Krankheitsbild. Die frühzeitige Diagnosestellung sowie Einleitung einer adäquaten Therapie sind ebenso essenziell wie die Klärung der Ätiologie. Bei Kindern ist die Krankheit vornehmlich genetisch bedingt, jedoch gelingt die Identifikation der genetischen Ursache in bis zu 30% der Fälle nicht. Auch bei unserer Indexpatientin konnte in den bisher mit der Nebennierenrinden-Insuffizienz assoziierten Genen keine Mutation, die die Krankheit erklärt, identifiziert werden. Infolgedessen wurden Gesamtgenomsequenzierungen der Patientinnen-DNA sowie der DNA der Eltern durchgeführt. Dabei wurde eine heterozygote de novo Stop-Mutation c.136C>T (p.Gln46*) im NXNL1-Gen identifiziert. Da oxidativer Stress als Pathomechanismus der Nebennierenrindeninsuffizienz bekannt ist und bereits gezeigt wurde, dass NXNL1 in der Retina eine Rolle in der Redoxhomöostase spielt, gerieten dieses Gen sowie die Stop-Mutation in den Fokus der Untersuchungen. Im Rahmen der Arbeit wurde das durch NXNL1 codierte gleichnamige Protein NXNL1 bezüglich Lokalisation, Funktion unter oxidativem Stress sowie Einfluss auf die Steroidbiosynthese in der Nebennierenrinde untersucht. Zeitgleich wurde evaluiert, ob die bei der Patientin detektierte Stop-Mutation die Lokalisation und Funktion des Proteins beeinflusst. Infolge fehlender Expression des Gens in herkömmlichen Zelllinien wurden mittels stabiler Transfektion von NCI-295R - sowie NCI-H295RA-Zellen mit NXNL1-WT- bzw. NXNL1-Q46*-Vektor-DNA adrenokortikale Zellmodelle generiert. Mittels Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass NXNL1 sowohl im Zytosol als auch im Zellkern der stabil transfizierten NCI-H295R- sowie NCI-H295RA-Klone lokalisiert ist. Weiterhin führte die stabile Transfektion mit NXNL1-WT-DNA zum verbesserten Überleben unter oxidativem Stress. Der Nachweis des aufgrund der Stop-Mutation verkürzten NXNL1 gelang weder im Western Blot noch mittels Immunfluoreszenz. Der Schutz des Zellüberlebens, den NXNL1 in stabil mit NXNL1-WT-DNA transfizierten Zellen unter oxidativem Stress bot, ging infolge der Stop-Mutation verloren. Interessanterweise hatte sowohl die Transfektion mit NXNL1-WT-DNA als auch mit NXNL1-Q46*-DNA Einfluss auf das Glutathionsystem der adrenokortikalen Zellklone unter oxidativem Stress. Die Abnahme der GSH/GSSG-Ratio sowie Zunahme der GSSG-Konzentration waren unter oxidativem Stress bei den untersuchten Klonen signifikant geringer als bei den Vergleichszellen. Auf die Steroidbiosynthese der adrenokortikalen Zellen hatte weder die Transfektion mit NXNL1-WT- noch mit NXNL1-Q46*-DNA nachweislichen Einfluss, sodass die vorliegende Arbeit Hinweise dafür liefert, dass NXNL1 in der Nebennierenrinde das Zellüberleben unter oxidativem Stress schützen kann, jedoch keine spezifische Funktion im Hormonstoffwechsel hat. Es ist denkbar, dass die Stop-Mutation im NXNL1 infolge des fehlenden Schutzes des Zellüberlebens unter oxidativem Stress bei der Indexpatientin zur Nebennierenrinden-Insuffizienz beigetragen haben kann. Bei einer vornehmlich autosomal rezessiv vererbten Krankheit wie der Nebennierenrinden-Insuffizienz ist es dennoch unwahrscheinlich, dass die heterozygote Stop-Mutation allein zur Krankheit führte. Dass ein ebenfalls in der Gesamtgenomsequenzierung detektierter Polymorphismus im Exon 2 des NXNL1 c.461A>T (p.Glu154Val) zusammen mit der Stop-Mutation in Exon 1 zu einem compound heterozygoten Vererbungsmuster geführt haben könnte, wurde ausgeschlossen. Um zu überprüfen, ob weitere Mutationen die Nebennierenrinden-Insuffizienz bei der Patientin bedingen, wurden zusätzlich eine Trio Analyse sowie optische Genomkartierung durchgeführt. Dabei wurden Mutationen in mehreren Genen detektiert, darunter SRCAP und INPP5B, deren Einfluss auf die Nebennierenrinden-Insuffizienz nicht genauer untersucht wurde und fraglich bleibt. Ein modulierender Einfluss ist denkbar. Trotz der weitreichenden Untersuchungen konnte nicht abschließend geklärt werden, inwiefern die Stop Mutation im NXNL1 zur Nebennierenrinden-Insuffizienz bei der Patientin beigetragen hat. Es wurde deutlich, dass die ätiologische Klärung insbesondere genetischer Krankheiten komplex und die Klärung der Krankheitsursache auch nach eingehender Untersuchung nicht immer möglich ist. Dennoch wird mit der Untersuchung neuer genetischer Varianten im Zusammen-hang mit seltenen Krankheiten ein wichtiger Beitrag geleistet, um den mensch¬lichen Organismus auf molekularer Ebene zu verstehen. / Primary adrenal insufficiency (PAI) is a potential life-threatening disease. Early diagnosis and initiation of an adequate therapy are just as essential as clarifying the etiology. In children, the disease is mainly genetically caused. However, the causing mutation remains unclear in up to 30% of cases. In our index case no disease-causing mutation in genes that are known to cause PAI was found either. Whole genome sequencing of the patients‘ and her parents‘ DNA revealed that the patient carries a heterozygous de novo stop mutation in NXNL1 (c.136C>T, p.Gln46*). Since oxidative stress is a known pathomechanism in PAI and NXNL1 plays a role in redox homeostasis, it was assumed that the mutation found in the index patient might contribute to PAI. In these studies, NXNL1 and its coded protein were investigated regarding localisation, function under oxidative stress conditions and influence on steroidogenesis in the human adrenal gland. Furthermore, it was evaluated, if the stop mutation found in our patient, influences the regular localization and function of NXNL1. Since NXNL1 was not expressed by conventional cell lines, cell models were generated via stable transfection. Adrenocortical NCI-H295R and NCI-H295RA cells were transfected either with NXNL1-wild type (WT) or NXNL1-Q46* vector DNA. It was shown that WT-NXNL1 is located in the cytoplasm, as well as in the nucleus of the adrenocortical cell clones. Furthermore, stable transfection with NXNL1-WT-DNA led to better survival under oxidative stress conditions. It was impossible to detect the mutated NXNL1 using Western blot and immunofluorescence. Furthermore, with NXNL1-Q46*-DNA transfected cells were not able to increase cell viability under oxidative stress. Interestingly, transfection with NXNL1-WT-DNA as well as transfection with NXNL1-Q46*-DNA influenced the glutathione system of the adrenocortical cells under oxidative stress conditions. The decrease of GSH/GSSG ratio and increase of GSSG concentration were significantly lower in transfected cells than in control cells under oxidative stress conditions. Neither transfection with NXNL1-WT-, nor with NXNL1-Q46*-DNA had proven influence on steroidogenesis of adrenocortical cells. Thus, the present work indicates that NXNL1 can protect cell survival under oxidative stress in adrenocortical cells but has no specific function in the adrenal hormone metabolism. Therefore, it is possible, that the mutation detected in NXNL1 could have contributed to patients PAI not directly through disrupting steroidogenesis but due to the lack of protection of cell survival under oxidative stress conditions. Since PAI is usually inherited in an autosomal recessive manner it is suspected that the heterozygous mutation in NXNL1 did not contribute to PAI alone. It was excluded that a polymorphism detected in Exon 2 of NXNL1 (c.461A>T, p.Glu154Val) was inherited compound heterozygous, together with the stop mutation. In order to investigate whether further mutations could have contributed to PAI in the patient, trio analysis and optical genome mapping were performed. With these methods mutations in various genes such as SRCAP and INPP5B were detected, which were not examined in detail. Even if the influence of these variants remains unclear, modulating effects are possible. Despite the extensive investigations, it could not be clarified to what extent the stop mutation in NXNL1 contributed to PAI in the patient. This shows once more, how complex it is to answer the question of etiology, especially in genetically caused diseases. Nevertheless, investigating new genetic variants related to rare diseases contributes to better understanding of the human organism on a molecular level.

L'insuffisance surrénale primaire (ISP) se caractérise par un déficit en hormones stéroïdiennes lié à un trouble du cortex surrénal qui expose au risque d'insuffisance aiguë et de menace vitale. Actuellement, 80% des formes pédiatriques d'ISP sont d'origine génétique et 5% restent sans étiologie génétique identifiée. Les récentes découvertes de mutations de gènes du stress oxydant ouvrent le champ des recherches d'anomalies génétiques non spécifiques de la glande surrénale. Le séquençage parallèle massif (MPS) autorise aujourd'hui la réalisation de millions de séquences et l'étude simultanée de plusieurs gènes de plusieurs patients ce qui permet d'accélérer le diagnostic. C'est aussi la technique de choix pour la recherche de nouveaux gènes. Cependant, parmi les défis de cette nouvelle technologie, il est possible de citer la gestion de la très grande quantité de données qu'elle génère et le besoin d'une validation rigoureuse préalable à son utilisation à des fins diagnostiques.Le premier objectif du présent travail était d'établir un diagnostic génétique dans une cohorte de patients atteints d'ISP et de rechercher de nouveaux gènes. L'étude des génotypes et des phénotypes permet de comprendre les mécanismes physiopathologiques pour les engager dans le traitement et le conseil génétique.Le second objectif était le développement de méthodes bio-informatiques et d'inférence statistique pour faciliter le transfert du séquençage classique (Sanger) vers la technique MPS. Ce développement comprend l'analyse graphique de la qualité du séquençage, l'ajustement de modèles log-linéaires pour comparer les propriétés de différents « pipelines », et l'ajustement de modèles additifs généralisés pour estimer les contributions des sources d'erreurs de séquençage. Les analyses statistiques ont considéré chaque paire de bases comme unité statistique et chaque patient comme étude indépendante, ce qui confère à l'analyse simultanée de tous les patients le caractère d'une méta-analyse / Primary adrenal insufficiency (PAI) is characterized by an impaired production of steroid hormones due to an adrenal cortex defect. This condition exposes to the risk of acute insufficiency which may be life-threatening. Today, 80% of pediatric forms of PAI have a genetic origin but 5% have no clear genetic support. Recently discovered mutations in genes relative to the oxidative stress have opened the way to research works on genes unrelated to the adrenal gland. Massive Parallel Sequencing (MPS) is now able to perform millions of sequences and study simultaneously several genes in several patients, which accelerates the diagnosis. Above all, MPS is the preferred technique for new gene discoveries. However, among the challenges of this new technology one may cite the management of the huge amount of data MPS generates and the need for a strict validation process before the use of MPS for diagnosis purposes.The first objective of the present work was to establish a genetic diagnosis in a cohort of patients with PAI and search for new genes. Study the genotypes and phenotypes allows a better understanding of the physiopathological mechanisms of PAI and offering appropriate care for the patients and counseling for families. The second objective was the development of bioinformatic and statistical inference methods to help shifting from the classical Sanger sequencing to MPS. This shift involves a graphical analysis of the quality of sequencing, an adjustment of log-linear models to allow comparing the properties of different pipelines, an adjustment of the generalized additive models to allow estimating the contributions of various sources of sequencing errors. The statistical methods have considered each DNA base-pair as a statistical unit and each patient as a separate study which confers the simultaneous study of all patients the status of a meta-analysis