Cellular prion protein (PrPc) is a GPI–anchored protein, of unknown function, found in a number of cells throughout the body. It is now widely believed that a mis-folded, protease resistant form of this protein is responsible for a group of fatal neurodegenerative diseases called transmissible spongiform encephalopathies (TSE), including Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and kuru in humans, scrapie in sheep, chronic wasting disease (CWD) in deer and elk and bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle. Although the exact function of PrPc is unknown it has been implicated in copper binding, signal transduction and cell adhesion. The pathogenesis of prion diseases is poorly understood, however it is known that PrPc must be present in order for the disease to progress. Platelets have been shown to be the largest reservoir of PrPc in peripheral blood cells and previous studies in animal models have suggested platelets may also be involved in TSE infectivity. In this study, we determine the exact location of PrPc within human platelets, examine the mobilization and release of PrPc from activated platelets on both microvesicles and exosomes and suggest a possible role for platelets in prion infectivity. In addition we examine the role of PrPc within normal platelet functions including aggregation, signal transduction and adhesion.

Leila Kupfer Einflüsse der Aminosäuresequenz und erregerspezifischer Eigenschaften auf die Konvertierbarkeit chimärer Prion-Proteine in vitro Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger des Friedrich-Loeffler-Institutes, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems Eingereicht im Februar 2007 127 Seiten, 40 Abbildungen, 4 Tabellen, 230 Literaturangaben, 13 Seiten Anhang Schlüsselwörter: zellfreie Konversion, chimäres Prion-Protein, Aminosäuresequenz, stammspezifische Eigenschaften Die genauen molekularen Mechanismen bei der Entstehung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind immer noch nicht eindeutig geklärt. Es wird vermutet, dass das auslösende Ereignis, die irreversible Umfaltung oder Konversion eines körpereigenen Membranproteins, des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine krankheitsassoziierte, Proteinase K (PK) resistente Isoform PrPSc, eine ‚autokatalytische’ Konversionsreaktion initiiert. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass dabei die Aminosäuresequenzen des PrPC und PrPSc die Effizienz dieser Konversionsreaktion sowohl bei Übertragungen innerhalb derselben Spezies als auch über Speziesgrenzen hinweg beeinflussen. Am Friedrich-Loeffler-Institut wurden in vergangenen Arbeiten zwei transgene Inzucht-Mauslinien etabliert, die auf der Basis von amino- und carboxyterminalen murinen Anteilen ein chimäres PrPC mit zentralen ovinen (Tgmushp XIX) oder bovinen (Tgmubo XIII) Sequenzen exprimieren. Erstaunlicherweise erwiesen sich die Tgmubo XIII-Mäuse als nahezu resistent gegen verschiedene TSE-Erreger aus Schaf, Rind und Maus, während die Tiere der Linie Tgmushp XIX ausgesprochen gut infizierbar waren. Da sich die PrP-Sequenz dieser beiden Mauslinien um lediglich vier Aminosäurereste unterscheidet, war es Ziel dieser Studie zu ermitteln, welcher Aminosäure-Austausch die verminderte Infizierbarkeit der Tgmubo XIII bedingt. Um kostenspielige und zeitaufwenige Tierversuche zu vermeiden, wurde hierzu ein zellfreier Konversionsansatz gewählt. Dieser birgt den Vorteil, dass die molekularen Einflüsse auf die Konversion in einem stark vereinfachten System innerhalb weniger Tage festgestellt werden können. Insgesamt wurden 19 verschiedene PrPC-Mutanten kloniert, in E. coli rekombinant exprimiert, affinitätschromatographisch aufgereinigt und im zellfreien Konversionsassay mit Zusammenfassung 85 ebenfalls hochaufgereinigtem PrPSc aus Gehirnextrakten final BSE- oder Scrapie-infizierter (drei unterschiedliche Erregerstämme: Me7, 22A, 87V) Mäuse für bis zu drei Tage inkubiert. Die stattgefundene Konversion der Mutanten wurde anschließend mittels PK-Verdau festgestellt. Die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse für Tgmubo XIII und Tgmushp XIX konnten so in vitro für PrP-mubo und PrP-mushp bestätigt werden, d.h. nur letzteres wurde in ein PK-resistentes PrPres-Fragment konvertiert. Ausgehend von PrP-mushp wurden die vier unterschiedlichen Positionen gegen die jeweils entsprechende Aminosäure aus PrP-mubo mutiert. Dabei zeigte der Austausch von Asparagin gegen Serin auf Position 142 der chimären Sequenz den stärksten Effekt: PrP-mushpN142S ließ sich nur durch Koinkubation mit BSE-, aber nicht mehr durch Scrapie-PrPSc konvertieren. Substitutionen durch Alanin oder Glutamin führten zu einer weiteren Minderung der Konversionsrate. Auch beim Austausch mehrerer Aminosäuren in Kombination mit Serin an Position 142 wurde der hemmende Effekt dieser Substitution deutlich. Einen ähnlichen, wenn auch nicht ganz so starken Einfluss hatten Aminosäureaustausche auf Position 185. Wurde dort anstelle von Glutamin Glutamat eingefügt, konnte das so entstandene Konstrukt PrP-mushpQ185E nicht mehr durch Me7 aber noch durch 22A, 87V und BSE konvertiert werden. Wurde Glutamin durch Alanin oder Asparagin ersetzt, verminderte sich die Konversionsrate für 22A, 87V und BSE. Diese Effekte traten nur bei chimärem PrPC auf. Der singuläre Austausch der entsprechenden Aminosäuren 146 und 189 der ovinen Sequenz gegen die des bovinen PrPC zeigten keine derartige Hemmung der Konvertierbarkeit. Genauso wenig hatte die Deletion des Aminoterminus der chimären Prion-Proteine einen hemmenden Effekt. Lediglich nach Inkubation mit mauspassagierter BSE stellte sich das PrPres-Fragment des PrP-mushpΔ94 als Doppelbande im Immunoblot dar, deren Bedeutung jedoch unbekannt ist. Durch den zellfreien Konversionsassay konnten die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse bezüglich der Empfänglichkeit der transgenen, chimäres Prion-Protein exprimierenden Mauslinien bestätigt werden. Die Erkenntnis, dass zwei Aminosäuren der chimären Sequenz für die Inkonvertibilität verantwortlich sind, zeigt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Primärstruktur des Prion-Proteins und dessen Überführbarkeit in seine pathologische Isoform besteht. Zusätzlich konnten stammspezifische Effekte auf die zellfreie Konversion ermittelt werden, die zum einen ebenfalls von der Aminosäuresequenz des rekombinanten PrPC, zum anderen aber auch von den Eigenschaften des jeweiligen eingesetzten Stammes abhängen. Die in der vorgestellten Arbeit ermittelten Ergebnisse untermauern die Prionhypothese, wonach einzelne Aminosäuren des Prion-Proteins die Erregervermehrung maßgeblich beeinflussen können. Allerdings werfen die beobachteten stammspezifischen Effekte auch bisher ungelöste Fragen zu den dabei zugrunde liegenden Mechanismen auf

A proteína prion celular (PrPC) consiste em uma glicoproteína de membrana que atua como receptora para diversas moléculas, desencadeando sinais intracelulares. Ao interagir com a co-chaperona STIP1, PrPC promove a autorrenovação e proliferação de células-tronco/progenitoras neurais (NSPCs) durante a fase embrionária. De fato, PrPC tem se destacado por sua participação na neurogênese embrionária e adulta, porém o papel de sua interação com a proteína STIP1 na neurogênese adulta permanece obscuro. Deste modo, o presente trabalho adotou abordagens in vitro para avaliação do complexo PrPC-STIP1 em processos celulares que culminam na neurogênese adulta. Para isso, culturas primárias de NSPCs de camundongos deficientes (Prnp-/-) e tipo-selvagens (Prnp+/+) para PrPC foram realizadas, e a cultura foi devidamente padronizada e caracterizada. Através de ensaios de autorrenovação, proliferação e migração celular sugere-se que PrPC promove estes eventos celulares independentemente de STIP1, e que possivelmente a proteína laminina seja um alvo crítico para migração via PrPC. / Cellular prion protein (PrPC) consists in a membrane glycoprotein that acts as a receptor to several molecules, triggering intracellular signals. By interacting with co-chaperone STIP1, PrPC promotes self-renewal and proliferation of neural stem/progenitor cells (NSPCs) during embryonic stage. Indeed, PrPC has excelled for its participation in embryonic and adult neurogenesis, but the role of its interaction with STIP1 protein in adult neurogenesis remains unclear. Thus, herein it was adopted in vitro approaches in order to evaluate the PrPC-STIP1 complex on cellular processes that culminate in adult neurogenesis. In order to assess that, NSPC primary cultures of PrPC deficient (Prnp-/-) and wild-type (Prnp+/+) mice were performed, and the culture was properly standardized and characterized. Through self-renewal, proliferation and cell migration assays, it was suggested that PrPC promotes these cellular events regardless of STIP1, and possibly the laminin protein is a critical target for migration via PrPC.

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Leila Kupfer Einflüsse der Aminosäuresequenz und erregerspezifischer Eigenschaften auf die Konvertierbarkeit chimärer Prion-Proteine in vitro Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger des Friedrich-Loeffler-Institutes, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems Eingereicht im Februar 2007 127 Seiten, 40 Abbildungen, 4 Tabellen, 230 Literaturangaben, 13 Seiten Anhang Schlüsselwörter: zellfreie Konversion, chimäres Prion-Protein, Aminosäuresequenz, stammspezifische Eigenschaften Die genauen molekularen Mechanismen bei der Entstehung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind immer noch nicht eindeutig geklärt. Es wird vermutet, dass das auslösende Ereignis, die irreversible Umfaltung oder Konversion eines körpereigenen Membranproteins, des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine krankheitsassoziierte, Proteinase K (PK) resistente Isoform PrPSc, eine ‚autokatalytische’ Konversionsreaktion initiiert. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass dabei die Aminosäuresequenzen des PrPC und PrPSc die Effizienz dieser Konversionsreaktion sowohl bei Übertragungen innerhalb derselben Spezies als auch über Speziesgrenzen hinweg beeinflussen. Am Friedrich-Loeffler-Institut wurden in vergangenen Arbeiten zwei transgene Inzucht-Mauslinien etabliert, die auf der Basis von amino- und carboxyterminalen murinen Anteilen ein chimäres PrPC mit zentralen ovinen (Tgmushp XIX) oder bovinen (Tgmubo XIII) Sequenzen exprimieren. Erstaunlicherweise erwiesen sich die Tgmubo XIII-Mäuse als nahezu resistent gegen verschiedene TSE-Erreger aus Schaf, Rind und Maus, während die Tiere der Linie Tgmushp XIX ausgesprochen gut infizierbar waren. Da sich die PrP-Sequenz dieser beiden Mauslinien um lediglich vier Aminosäurereste unterscheidet, war es Ziel dieser Studie zu ermitteln, welcher Aminosäure-Austausch die verminderte Infizierbarkeit der Tgmubo XIII bedingt. Um kostenspielige und zeitaufwenige Tierversuche zu vermeiden, wurde hierzu ein zellfreier Konversionsansatz gewählt. Dieser birgt den Vorteil, dass die molekularen Einflüsse auf die Konversion in einem stark vereinfachten System innerhalb weniger Tage festgestellt werden können. Insgesamt wurden 19 verschiedene PrPC-Mutanten kloniert, in E. coli rekombinant exprimiert, affinitätschromatographisch aufgereinigt und im zellfreien Konversionsassay mit Zusammenfassung 85 ebenfalls hochaufgereinigtem PrPSc aus Gehirnextrakten final BSE- oder Scrapie-infizierter (drei unterschiedliche Erregerstämme: Me7, 22A, 87V) Mäuse für bis zu drei Tage inkubiert. Die stattgefundene Konversion der Mutanten wurde anschließend mittels PK-Verdau festgestellt. Die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse für Tgmubo XIII und Tgmushp XIX konnten so in vitro für PrP-mubo und PrP-mushp bestätigt werden, d.h. nur letzteres wurde in ein PK-resistentes PrPres-Fragment konvertiert. Ausgehend von PrP-mushp wurden die vier unterschiedlichen Positionen gegen die jeweils entsprechende Aminosäure aus PrP-mubo mutiert. Dabei zeigte der Austausch von Asparagin gegen Serin auf Position 142 der chimären Sequenz den stärksten Effekt: PrP-mushpN142S ließ sich nur durch Koinkubation mit BSE-, aber nicht mehr durch Scrapie-PrPSc konvertieren. Substitutionen durch Alanin oder Glutamin führten zu einer weiteren Minderung der Konversionsrate. Auch beim Austausch mehrerer Aminosäuren in Kombination mit Serin an Position 142 wurde der hemmende Effekt dieser Substitution deutlich. Einen ähnlichen, wenn auch nicht ganz so starken Einfluss hatten Aminosäureaustausche auf Position 185. Wurde dort anstelle von Glutamin Glutamat eingefügt, konnte das so entstandene Konstrukt PrP-mushpQ185E nicht mehr durch Me7 aber noch durch 22A, 87V und BSE konvertiert werden. Wurde Glutamin durch Alanin oder Asparagin ersetzt, verminderte sich die Konversionsrate für 22A, 87V und BSE. Diese Effekte traten nur bei chimärem PrPC auf. Der singuläre Austausch der entsprechenden Aminosäuren 146 und 189 der ovinen Sequenz gegen die des bovinen PrPC zeigten keine derartige Hemmung der Konvertierbarkeit. Genauso wenig hatte die Deletion des Aminoterminus der chimären Prion-Proteine einen hemmenden Effekt. Lediglich nach Inkubation mit mauspassagierter BSE stellte sich das PrPres-Fragment des PrP-mushpΔ94 als Doppelbande im Immunoblot dar, deren Bedeutung jedoch unbekannt ist. Durch den zellfreien Konversionsassay konnten die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse bezüglich der Empfänglichkeit der transgenen, chimäres Prion-Protein exprimierenden Mauslinien bestätigt werden. Die Erkenntnis, dass zwei Aminosäuren der chimären Sequenz für die Inkonvertibilität verantwortlich sind, zeigt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Primärstruktur des Prion-Proteins und dessen Überführbarkeit in seine pathologische Isoform besteht. Zusätzlich konnten stammspezifische Effekte auf die zellfreie Konversion ermittelt werden, die zum einen ebenfalls von der Aminosäuresequenz des rekombinanten PrPC, zum anderen aber auch von den Eigenschaften des jeweiligen eingesetzten Stammes abhängen. Die in der vorgestellten Arbeit ermittelten Ergebnisse untermauern die Prionhypothese, wonach einzelne Aminosäuren des Prion-Proteins die Erregervermehrung maßgeblich beeinflussen können. Allerdings werfen die beobachteten stammspezifischen Effekte auch bisher ungelöste Fragen zu den dabei zugrunde liegenden Mechanismen auf

Scrapie und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) sind stets tödlich verlaufende transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) bei kleinen Wiederkäuern und Rindern. Nach der „Prion-Theorie“ ist die pathologische Isoform eines zellulären Proteins, des Prion-Proteins, der Hauptbestandteil, wenn nicht sogar die einzige Komponente der TSE-Erreger. Gemäß dieser Theorie lagert sich die pathologische Isoform, PrPSc, an die zelluläre Form, PrPC, an und führt so zu einer Konformationsänderung von PrPC. Bisher lassen sich TSE-Erreger nur im Tierversuch sowie in wenigen überwiegend von Nagetieren stammenden Zelllinien vermehren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb die Identifikation und Charakterisierung neuer TSE-empfänglicher Zelllinien, wobei vor allem die Infektion oviner und boviner Zelllinien mit Scrapie- bzw. BSE-Feldisolaten im Vordergrund stand. Hierzu wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Kultur- und Infektionsbedingungen (Nährmedien, Umsetzraten, Temperatur, Herstellung der Inokulate, Inokulationsprotokoll) auf den Infektionserfolg studiert. Basierend auf den dabei gewonnenen Daten wurde ein Infektionsprotokoll erstellt, das im weiteren Verlauf für alle in dieser Studie untersuchten Zelllinien verwendet wurde. Durch die Zellbank des Friedrich-Loeffler-Instituts stand eine Vielzahl unterschiedlicher eukaryotischer Zelllinien zur Verfügung, von denen 53 aus geeigneten Organen und Geweben und größtenteils vom Wiederkäuer stammende Zelllinien ausgewählt wurden. Anschließend wurden diese Zelllinien kultiviert und wiederholt hinsichtlich ihrer PrPC-Expression analysiert. Dabei zeigte sich, dass das PrPC-Expressionniveau für jede Zelllinie sehr individuell und weder spezies- noch gewebespezifisch ist. 34 der 53 Zelllinien exprimierten PrPC in detektierbarer Menge und wurden in den weiteren Infektionsstudien verwendet. Dabei wurden sie mit verschiedenen TSE-Stämmen bzw. -Isolaten (bovines BSE-Material, ovines und caprines Scrapie-Material, mausadaptierte BSE- und Scrapie-Stämme) inokuliert. Der Großteil dieser Zelllinien (30 von 34) zeigte sich gegen alle eingesetzten Prion-Erreger resistent. Zwei Zelllinien konnten transient für 10 (MGbov900) bzw. 32 (Bov11) Passagen mit bovinem BSE-Material infiziert werden. Damit war die prinzipielle Möglichkeit einer BSE-Infektion dieser Zellen gezeigt. Aus bisher ungeklärten Gründen wurde die Prion-Infektion jedoch von beiden Zelllinien wieder verloren und erneute Infektionsversuche blieben erfolglos. Zwei weitere Zelllinien konnten persistent infiziert werden. Die Zelllinie N2a229, eine Sublinie der in der Prion-Forschung weit verbreiteten Neuroblastomzelllinie N2a, war für den mauspassagierten Scrapie-Stamm RML empfänglich. Des Weiteren wurde eine bovine Zelllinie (Bov5; 154PES) identifiziert, die für zwei ovine Scrapie-Feldisolate empfänglich war. Es handelt sich dabei um die erste nicht transgene Zelllinie, die mit einem Scrapie-Feldisolat infiziert werden konnte. Die beiden verwendeten Isolate (S71/04 und S95/04) stammten von Schafen aus einem klassischen Scrapie-Ausbruch aus dem Jahr 2004. In den infizierten Bov5Sc-Zellen steigerte sich die initial schwache PrPSc-Akkumulation über mehrere Passagen zu einem starken Signal, das durch verschiedene Prion-spezifische Antikörper im Dot-Blot, im Western-Blot und mit dem „Zell-ELISA“ nachgewiesen werden konnte. Die Infektion ist bereits seit über 200 Passagen stabil. Sie war mit den besagten Scrapie-Isolaten mehrfach wiederholbar und durch die Selektion von infizierten Einzelzellen konnten hochpositive Sublinien erhalten werden. Infizierte Bov5Sc-Zellen führten nach Inokulation in transgene Rinder- oder Schaf-PrPC überexprimierende Mäuse zu Scrapie-Erkrankungen und der Bildung von PrPSc im Gehirn der Mäuse. Die Infektion von Rinderzellen mit einem ovinen TSE-Isolat bedeutete die Überwindung einer Speziesbarriere. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Adaptation des Erregers an die Zellen stattgefunden hatte, welche sich z. B. in einem veränderten Glykosylierungs-profil darstellt. Verglichen mit zwei murinen TSE-infizierten Zelllinien zeigten die Bov5Sc-Zellen ähnliche Eigenschaften hinsichtlich ihrer Proteinase K-Resistenz, aber eine deutlich verlängerte Reaktionszeit gegenüber PrPSc inhibierenden Substanzen. Neben den Infektionsstudien an den „Zellbank-Zelllinien“ wurden transgene Zelllinien hergestellt, die auf der Basis von RK13-Zellen (Nierenzellen aus dem Kaninchen) und Hpl3-4-Zellen (neuronale Zelle aus PrP-defizienten-Mäusen) das PrPC von Maus, Schaf, Nerz, Hund sowie zwei chimären Konstrukten aus Maus/Rind/Maus bzw. Maus/Schaf/Maus exprimierten. Ein Großteil dieser transgenen Zelllinien war gegenüber einer Infektion und insbesondere einer Infektion mit TSE-Feldisolaten resistent. Durch Infektionsstudien mit dem mausadaptierten murinen Scrapie-Stamm RML konnten jedoch interessante Einblicke in die Hintergründe der zellulären TSE-Empfänglichkeit gewonnen werden. So zeigte sich, dass die Expression eines chimären PrP-Konstruktes aus Maus und Schaf (Mushp) nur in RK13-Zellen, nicht aber in Hpl3-4-Zellen zu einer für den Scrapie-Stamm RML empfänglichen Zelllinie führte. Dagegen konnten murines PrPC exprimierende Hpl3-4-Zellen erfolgreich mit RML, nicht aber mit dem Stamm Me7 infiziert werden. Diese Versuche unterstützen die Annahme, dass für eine Zellinfektion weitere zelluläre Komponenten eine Rolle spielen und zeigen, dass nur die richtige Kombination aus exprimiertem PrPC und zellulärem Hintergrund die Empfänglichkeit einer Zelllinie für einen speziellen TSE-Erreger bestimmen kann. Weitere Studien mit empfänglichen bzw. infizierten bovinen Zelllinien werden zu einem besseren Verständnis der zellulären Pathogenese bei BSE und Scrapie führen, woraus sich möglicherweise auch ein therapeutischer und diagnostischer Nutzen ziehen lässt.

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京都大学 / 新制・論文博士 / 博士(医科学) / 乙第13482号 / 論医科博第8号 / 新制||医科||9(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 岩田 想, 教授 秋山 芳展, 教授 近藤 玄 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Prionkrankheiten sind übertragbare, tödliche neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen und bei Tieren. Sie basieren auf der Konversion des zellulären Prion-Proteins (PrPC) in seine pathogene Form (PrPSc). Durch diese Konversion sind Prionkrankheiten pathogen und übertragbar. Bis heute ist weder der dem zugrunde liegende Mechanismus verstanden noch eine Behandlung gefunden worden. Die sichere Diagnose einer sporadischen Prionkrankheit ist ausschließlich mittels Gehirnbiopsie möglich, weswegen zu Lebzeiten des Patienten häufig nur die Diagnose einer wahrscheinlichen Prionkrankheit erfolgt. Zusammen mit der klinischen Heterogenität der Prionkrankheiten weisen neueste Erkenntnisse auf das Vorhandensein mehrerer humaner Prionstämme hin. Für die Suche nach Medikamenten fehlt ein geeigneter Wirkstoff-Suchtest, der auf der humanen Pathogenese basiert, für einen hohen Durchsatz geeignet und gut reproduzierbar ist. Die real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC), eine neu entwickelte in vitro-Methode, erlaubt den Nachweis von bisher nicht messbaren Mengen an PrPSc in humanem Liquor cerebrospinalis (Liquor). Dazu werden die selbst-replizierenden Eigenschaften des PrPSc genutzt. Erste Untersuchungen weisen auf distinkte Eigenschaften humaner Prionkrankheiten in der RT-QuIC hin. Zum Einsatz in Diagnostik und Forschung bedarf es jedoch einer umfassenden Validierung der Methode für die Anwendung mit humanem Liquor. In dieser Arbeit beträgt die Sensitivität der RT-QuIC 85,5 % und die Spezifität 99,5 % für humane Prionkrankheiten. Die Reproduzierbarkeit im Ringversuch ist gut bis exzellent. Die Kurzzeitlagerungen der Liquorproben bei Raumtemperatur und +4°C sowie die Langzeitlagerung bei −80°C und das wiederholte Einfrieren und Auftauen haben keinen Einfluss auf die Testergebnisse. Jedoch führt die Kontamination mit Blut zu falsch-negativen Resultaten. Diese Ergebnisse weisen auf eine Eignung der RT-QuIC zur sicheren Diagnose von Prionkrankheiten zu Lebzeiten der Patienten hin. Zur Charakterisierung des Reaktionspotentials möglicher humaner Prionstämme wurden Liquorproben von verschiedenen humanen Prionkrankheiten wie bspw. der sporadischen und der genetischen Form mittels RT-QuIC untersucht. Die Auswertung der Daten zeigt distinkte Eigenschaften des PrPSc im Liquor, die moduliert werden durch die Form der Prionkrankheit, den Prnp Codon 129-Genotyp und die Krankheitsdauer. Diese Ergebnisse zeigen das Potential der RT-QuIC, die selbst-replizierenden Eigenschaften des PrPSc im Liquor zu untersuchen, womit erstmals eine Methode zur Verfügung steht, um diese Effekte in Patienten während der symptomatischen Phase zu studieren. Zur Nutzung der RT-QuIC als neuartige Methode zur Wirkstoffsuche wurde die Wirkung mehrerer Stoffe auf die RT-QuIC-Reaktion untersucht. Doxyzyklin inhibiert diese Reaktion sowohl in Korrelation mit der Dosis als auch mit dem Zeitpunkt der Zugabe. Diese Ergebnisse weisen auf eine Eignung der RT-QuIC zur Suche von Stoffen hin, die den PrP-Konversionsprozess inhibieren und zeigen die inhibierende Wirkung von Doxyzyklin auf die in-vitro-Amplifikation von PrPSc.

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