Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 76-78. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

La profondeur de champ est un paramètre crucial pour la conception des systèmes optiques. Cette affirmation est particulièrement vraie dans le cas des microscopes. Plusieurs solutions ont été proposées dans le passé pour contourner les limites imposées par ce paramètre. L'ingénierie du front d'onde consiste par exemple à ajouter un masque de phase dans le système optique pour rendre la fonction de transfert optique invariante par rapport à la position axiale de l'objet. Ce mémoire propose d'atteindre ce but en optimisant des masques de phase polynomiaux par la méthode du recuit simulé. L'invariance de la fonction de transfert optique est assurée par la minimisation d'une fonction de coût faisant intervenir la MTF du système optique en fonction de l'aberration du défocus. L'optique de Fourier est utilisée pour obtenir cette information à partir d'un modèle théorique du microscope. Les masques de phases sont optimisés selon deux géométries en particulier : le système de coordonnées cartésiennes séparables et la symétrie de rotation. Cette façon de procéder permet d'évaluer un grand nombre de solutions différentes dans un temps raisonnable, ce qui maximise les chances d'atteindre le minimum global de la fonction de coût. Le meilleur masque ainsi obtenu est fabriqué par la méthode des gravures binaires successives. Cette technique photolithographique permet d'obtenir quatre niveaux de phase. Le masque fabriqué est finalement ajouté au montage du microscope afin de vérifier son effet sur la profondeur de champ. Les résultats obtenus après déconvolution des images acquises respectent le but initialement fixé.

Une augmentation de la profondeur de champs d'un système d'analyse cytologique par introduction d'un masque de phase couplé à un traitement numérique des images est proposée. La conception et l'optimisation des paramètres d'un masque de phase cubique ont été faites à l'aide du logiciel de conception optique Zemax®. Les masques de phase optimisés ont été réalisés selon 2 méthodes de fabrication. L'algorithme de traitement d'image par déconvolution ainsi que l'ajustement des pas de discrétisation des spectres nécessaires à ce traitement sont aussi démontrés dans ce mémoire. Finalement, les images résultantes présentent une profondeur de champs 20 fois plus grande que celle du système initial. / This thesis displays an extension of the depth of field of a cytologic System by introduction of a phase mask coupled with post-digital image processing. The phase masks parameters have been optimized using the Zemax® optical design software. The optimized cubic phase masks were fabricated using two different methods. An analysis of the fabricated phase masks and their performances are shown. The image processing deconvolution algorithm and the resulting depth extended images are also presented in this thesis. Finally, the depth of field of the cytologic System has been extended by 20 times.

Un des plus grands défis de la neuroscience moderne pour parvenir à comprendre et diagnostiquer les maladies du cerveau est de déchiffrer les détails des interactions neuronales dans le cerveau vivant. Pour ce faire, on doit être capable d'observer des populations de cellules vivantes dans leur matrice d'origine avec une bonne résolution spatiale et temporelle. La microscopie à deux photons se prête bien à cet exercice car elle permet d'exciter des fluorophores à de grandes profondeurs dans les tissus biologiques et elle offre une résolution spatiale de l'ordre du micron. Malheureusement, la très bonne résolution tridimensionnelle diminue la résolution temporelle, car l'effet de sectionnement optique causé par la faible profondeur de champ du microscope nous oblige à balayer les échantillons épais une multitude de fois avant de pouvoir compléter l'acquisition d'un grand volume. Dans ce projet de doctorat, nous avons conçu, construit et caractérisé un microscope à deux photons avec une profondeur de champ étendue afin de faciliter l'imagerie fonctionnelle de neurones dans un échantillon épais. Pour augmenter la profondeur de champ du microscope à deux photons, nous avons modifié le faisceau laser entrant dans le système optique afin de générer une aiguille de lumière, orientée axialement, dans l'échantillon au lieu d'un point. Nous modifions le faisceau laser avec un axicon, une lentille en forme de cône qui transforme le faisceau gaussien en un faisceau quasi non-diffractant, de type Bessel-Gauss. Le faisceau d'excitation conserve donc la même résolution transverse à différentes profondeurs dans l'échantillon, éliminant le besoin de balayer l'échantillon à répétition afin de sonder un volume complet. Dans cette thèse, nous démontrons que le microscope à grande profondeur de champ fonctionne effectivement tel que nous l'avons conçu et nous l'utilisons pour faire de l'imagerie calcique dans un réseau tridimensionnel de neurones vivants. Nous présentons aussi les différents avantages de notre système par rapport à la microscopie à deux photons conventionnelle. / One of the greatest challenges of modern neuroscience that will lead to a better understanding and earlier diagnostics of brain sickness is to decipher the details of neuronal interactions in the living brain. To achieve this goal, we must be capable of observing populations of living cells in their original matrix with a good resolution, both spatial and temporal. Two-photon microscopy offers the right tools for this since it presents with a spatial resolution in the order of the micron. Unfortunately, this very good three-dimensional resolution lowers the temporal resolution because the optical sectioning caused by the microscope's small depth of field forces us to scan thick samples repeatedly when acquiring data from a large volume. In this doctoral project, we have designed, built and characterized a two-photon microscope with an extended depth of field with the goal of simplifying the functional imaging of neurons in thick samples. To increase the laser scanning microscope's depth of field, we shaped the laser beam entering the optical system in such a way that a needle of light is generated inside the sample instead of a spot. We modify the laser beam with an axicon, a cone-shaped lens that transforms a gaussian beam into a quasi non-diffractive beam called Bessel-Gauss beam. The excitation beam therefore maintains the same transverse resolution at different depths inside the sample, eliminating the need for many scans in order to probe the entire volume of interest. In this thesis, we demonstrate that the extended depth of field microscope effectively works as we designed it, and we use it to image calcium dynamics in a three-dimensional network of live neurons. We also present the different advantages of our system in comparison with standard two-photon microscopy.