Orientador: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Eduardo Bagagli / Banca: Adriana Pardini Vicentini Moreira / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis, é o agente da paracoccidioidomicose, a micose profunda endêmica na América Latina. Produção de eicosanóides, como prostaglandinas e leucotrienos, durante as infecções fúngicas tem mostrado desempenhar um papel crítico na sobrevivência e/ou crescimento fúngico, bem como na modulação da resposta imune do hospedeiro. As células hospedeiras são uma fonte desses mediadores, porém outra fonte em potencial pode ser o próprio fungo. O objetivo do nosso estudo foi avaliar se cepas do P. brasiliensis com diferentes graus de virulência (Pb18, Pb265, BT79, Pb192) produzem, prostaglandina E2 (PGE2) e leucotrieno B4 (LTB4). Além disso, verificamos se P. brasiliensis pode usar fontes exógenas de ácido araquidônico (AA), bem como as vias metabólicas dependentes das enzimas cicloxigenase (COX) e lipoxigenase (5-LO), para a produção de PGE2 e LTB4, respectivamente. Finalmente, uma possível associação entre esses eicosanóides e a viabilidade do fungo também foi avaliada. Demonstramos, usando ensaios de Elisa, que todas as cepas de P. brasiliensis, independente do seu grau de virulência, produzem altos níveis de PGE2 e LTB4 após 4h cultura que foram reduzidos após 8h. No entanto, em ambos os tempos da cultura, foram detectados níveis mais elevados de eicosanóides, quando as culturas foram complementadas com uma fonte exógena de AA. Diferentemente, o tratamento com indometacina, um inibidor da COX, ou MK886, um inibidor da 5-LO, induz a uma redução nos níveis de PGE2 e LTB4, respectivamente, bem como a viabilidade do fungo. Os dados fornecem evidências de que P. brasiliensis tem a capacidade de metabolizar, tanto AA endógeno como exógeno por vias dependentes da COX e 5-LO enzimas que participam da produção de PGE2 e LTB4, respectivamente, que são indispensáveis para a sua viabilidade. / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis, is the agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent deep mycosis in Latin America. Production of eicosanoids, such as prostaglandins and leukotrienes, during fungal infections is theorized to play a critical role on fungal survival and/or growth as well as on host immune response modulation. Host cells are one source of these mediators; however another potential source may be the fungal itself. The purpose of our study was to assess whether P. brasiliensis strains with different degree of virulence (Pb18, Pb265, PbBT79, Pb192) produce both, prostaglandin E2 (PGE2) and leukotriene B4 (LTB4). Moreover, we asked if P. brasiliensis can use exogenous sources of arachidonic acid (AA), as well as metabolic pathways dependent on cyclooxygenase ( COX) and lipooxygenase (5-LO ) enzymes, for PGE2 and LTB4 production , respectively. Finally, a possible association between these eicosanoides and fungus viability was assessed. We have demonstrated, using Elisa assays, that all P. brasiliensis strains, independently of their virulence degree, produce high PGE2 and LTB4 levels on 4h culture that were reduced after 8 h. However, in both culture times, higher eicosanoides levels were detected when culture medium was supplemented with exogenous AA. Differently, treatment with indomethacin, a COX inhibitor, or MK886, a 5-LO inhibitor, induces a reduction on PGE2 and LTB4 levels, respectively, as well as in fungus viability. The data provide evidence that P. brasiliensis has the capacity to metabolize either endogenous or exogenous AA by pathways dependent on COX and 5-LO enzymes for producing PGE2 and LTB4, respectively, that are critical for its viability. / Mestre

Resumo: Paracoccidioides brasiliensis (Pb), agente etiológico da paracoccidioidomicose, é um fungo dimórfico que sobrevive no interior de monócitos/macrófagos humanos não ativados. Estudos anteriores em nosso laboratório têm demonstrado que os monócitos humanos não ativados são incapazes de realizar atividade fungicida, e esse processo está associado com a capacidade do fungo induzir a produção de prostaglandinas (PGs), uma vez que, essas células são capazes de realizar atividade fungicida significativa após o tratamento com indometacina (INDO), um inibidor da produção de ciclooxigenase. No entanto, o processo de pré-ativação com IFN-γ, resulta em um parcial efeito compensatório sobre os efeitos inibidores das PGs, principalmente quando essas células são desafiadas com a cepa de baixa virulência do fungo. Assim, a proposta deste presente estudo foi avaliar se a ativação de monócitos humanos com outras citocinas como TNF-α e GM-CSF resulta em um efeito similar ao observado com IFN-γ. Uma outra questão a ser respondida é se esse processo poderia estar associado com alterações nos níveis de H2O2 e NO, que são moléculas efetoras envolvidas na atividade fungicida contra o P. brasiliensis, bem como nos níveis das citocinas TNF-α, IL-10 e IL-6. Culturas de monócitos do sangue periférico, obtidos de 20 indivíduos normais foram tratadas somente com INDO ou ativados com IFN-γ, TNF-α ou GM-CSF na presença ou ausência de INDO por 18h, e posteriormente desafiados com cepas de alta (Pb18) ou baixa (Pb265) virulência do P. brasiliensis por 4h. Após esse período, as culturas foram avaliadas quanto à atividade fungicida, produção de H2O2 e NO e expressão de mRNA para enzima óxido nítrico sintase (iNOS) por RT-PCR em tempo real. As concentrações de TNF-α, IL-6 e IL-10 nos sobrenadantes das coculturas foram avaliadas por ELISA. Nossos resultados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis (Pb), the etiological agent of paracoccidioidomycosis, is a dimorphic fungus that survives within nonactivated human monocytes/macrophages. Previous studies have demonstrated that the lack of fungicidal activity by nonactivated human monocytes is associated to fungus capacity to inducing prostaglandins release, since a significative fungicidal activity was detected after monocytes treatment with indomethacin (INDO), a cyclooxigenase inhibitor. However, cells activation with IFN-γ seems to partially compensating this inhibitory effect, mainly when cells were challenged with low virulent strain of the fungus. Here, we extended our studies, addressing whether monocytes activation with other cytokines such as TNF-α and GM-CSF results in a similar effect to that observed with IFN-γ. Moreover, we asked if this process could be associated with alterations on H2O2 and NO levels, the molecules involved in Pb killing, as well as in the levels of the cytokines TNF-α, IL-10 and IL-6. Peripheral blood monocytes obtained from 18 healthy donors were treated only with INDO or activated with IFN-γ, TNF-α or GM-CSF in presence or absence of INDO for 18h, and further challenged with high (Pb18) or low (Pb265) virulent strain of Pb for 4h. After, cultures were evaluated for fungicidal activity, H2O2 and NO release and expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA by real-time RT-PCR. The concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 on supernatants of cocultures were evaluated by ELISA. Our results provided evidence that human monocytes challenged with both strains of P. brasiliensis release prostaglandins that via induction of IL-10 and IL-6 inhibits TNF-α production. This process results in defective cell activation with consequent release of low H2O2 levels and lack of fungicidal activity by cells. However the inhibitory effect of PGs may be... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Luciene Alarcão Dias Melicio / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: João pessoa Araújo Junior / Banca: Heloisa Blotta / Banca: Gil Bernard / Doutor