Orientador: Maria Teresinha Serrão Peraçoli / Banca: Maria de Lourder Ribeiro de Souza da Cunha / Banca: Vanessa Lara / Banca: Iracilda Z. Carlos / Banca: Sueli Calvi / Resumo: Receptores Toll-like RECONHECER componentes distintos da FUNGOS para iniciar a resposta imune inata. Examinamos se Paracoccidioides brasiliensis OU SEUS gp43 antígenos imunodominantes pode modular IN VITRO E TLR2 TLR4 expressão e produção TRIGGER citocinas por monócitos humanos. Monócitos de indivíduos saudáveis ​​foram incubadas com gp43 LYPOPOLYSACCHARIDE, (LPS) ou mortas pelo calor FORMAS leveduriforme do P. brasiliensis em uma proporção de 50 monócitos por célula fúngica (Pb18) a 37 º C por 4h e 18h. A EXPRESSÃO DE TLR2 E TLR4 SOBRE SUPERFÍCIE monócitos, e TNF-alfa, IL-10 e IL-12p40 PRODUÇÃO foram determinados por citometria de fluxo e ELISA respectivamente. Os resultados mostraram que a estimulação de monócitos COM OU LPS Pb18 PROMOVIDO UP-regulação da expressão TLR2 E TLR4 SOBRE SUPERFÍCIE EM RELAÇÃO monócitos às células não-estimulados EM AMBAS AS 4H e 18h de cultura, e aumentaram os níveis de TNF-alfa, IL- 10 e IL-12p40 PRINCIPALMENTE EM 18H DA CULTURA. POR OUTRO LADO, E EXPRESSÃO TLR4 BAIXA ALTA TLR2 são evocados por gp43 AT 4H DA CULTURA, associadas a altos níveis de TNF-alfa. No entanto, após 18H UMA MUDANÇA DE ALTA E BAIXA TLR2 TLR4 EXPRESSÕES foi seguido por elevados níveis de IL-10 e IL-12p40. Estes resultados sugerem que a gp43 pode induzir um desequilíbrio entre RESPOSTAS pró e anti-inflamatório em FUNGOS-monócitos interações, um efeito modulatório na CAMINHO TLR. AS TNF-alfa pode estar envolvida na patogênese da paracoccidioidomicose, O EFEITO regulatórios induzidos por gp43, VIA upregulation de TLR2 EXPRESSÃO E IL-10 produção, pode ser importante para proteger contra a lesão de tecido que é descrito neste micose. / Abstract: Toll-like receptors recognize distinct components of fungi to initiate the innate immune íesponse. We examined whether Paracoccidioides brasiliensis ar its immunodominant antigen gp43 can modulate in vitro TLR2 and TLR4 expression and trigger cytokine production by human monocytes. Monocytes from healthy individuaIs were incubated with gp43, IypopoIysaccharide (LPS) or heat-killed yeast forms of P. brasiliensis in a ratio of 50 monocytes per funga! cell (pb 18) at 37°C for 4h and I8h. The expression of TLR2 and TLR4 on monocyte surface, and TNF-alpha, IL-Io and IL-I2p4o production were determined by flow cytometry and ELISA respectiveIy. The results showed that monocyte stimuIation with LPS ar Pb18 promoted up-reguIation ofthe TLR2 and TLR4 expression on monocyte surface in reIation to the non-stimuIated cells at both 4h and I8h ofculture, and induced higher IeveIs ofTNF-aIpha, IL-Io and IL-12p4o mainly at I8h of culture. On the other hand, high TLR4 and low TLR2 expression were elicited by gp43 at 4h of cuIture, associated with higher Ievels of TNF-aIpha. However, after 18h a change to high TLR2 and !ow TLR4 expressions was followed by e1evated levels of IL-Io and IL-12p4o. These results suggest that gp43 might induce an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in fungal-monocyte interactions by a modulatory effect on TLR pathway. As TNF-alpha may be invoIved in the pathogenesis of paracoccidioidomycosis, the regulatory effect induced by gp43, via upregulation of TLR2 expression and IL-Io production, can be important to protect against tissue injury which is described in this mycosis. / Doutor

Resumo: Paracoccidioides brasiliensis (Pb), agente etiológico da paracoccidioidomicose, é um fungo dimórfico que sobrevive no interior de monócitos/macrófagos humanos não ativados. Estudos anteriores em nosso laboratório têm demonstrado que os monócitos humanos não ativados são incapazes de realizar atividade fungicida, e esse processo está associado com a capacidade do fungo induzir a produção de prostaglandinas (PGs), uma vez que, essas células são capazes de realizar atividade fungicida significativa após o tratamento com indometacina (INDO), um inibidor da produção de ciclooxigenase. No entanto, o processo de pré-ativação com IFN-γ, resulta em um parcial efeito compensatório sobre os efeitos inibidores das PGs, principalmente quando essas células são desafiadas com a cepa de baixa virulência do fungo. Assim, a proposta deste presente estudo foi avaliar se a ativação de monócitos humanos com outras citocinas como TNF-α e GM-CSF resulta em um efeito similar ao observado com IFN-γ. Uma outra questão a ser respondida é se esse processo poderia estar associado com alterações nos níveis de H2O2 e NO, que são moléculas efetoras envolvidas na atividade fungicida contra o P. brasiliensis, bem como nos níveis das citocinas TNF-α, IL-10 e IL-6. Culturas de monócitos do sangue periférico, obtidos de 20 indivíduos normais foram tratadas somente com INDO ou ativados com IFN-γ, TNF-α ou GM-CSF na presença ou ausência de INDO por 18h, e posteriormente desafiados com cepas de alta (Pb18) ou baixa (Pb265) virulência do P. brasiliensis por 4h. Após esse período, as culturas foram avaliadas quanto à atividade fungicida, produção de H2O2 e NO e expressão de mRNA para enzima óxido nítrico sintase (iNOS) por RT-PCR em tempo real. As concentrações de TNF-α, IL-6 e IL-10 nos sobrenadantes das coculturas foram avaliadas por ELISA. Nossos resultados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis (Pb), the etiological agent of paracoccidioidomycosis, is a dimorphic fungus that survives within nonactivated human monocytes/macrophages. Previous studies have demonstrated that the lack of fungicidal activity by nonactivated human monocytes is associated to fungus capacity to inducing prostaglandins release, since a significative fungicidal activity was detected after monocytes treatment with indomethacin (INDO), a cyclooxigenase inhibitor. However, cells activation with IFN-γ seems to partially compensating this inhibitory effect, mainly when cells were challenged with low virulent strain of the fungus. Here, we extended our studies, addressing whether monocytes activation with other cytokines such as TNF-α and GM-CSF results in a similar effect to that observed with IFN-γ. Moreover, we asked if this process could be associated with alterations on H2O2 and NO levels, the molecules involved in Pb killing, as well as in the levels of the cytokines TNF-α, IL-10 and IL-6. Peripheral blood monocytes obtained from 18 healthy donors were treated only with INDO or activated with IFN-γ, TNF-α or GM-CSF in presence or absence of INDO for 18h, and further challenged with high (Pb18) or low (Pb265) virulent strain of Pb for 4h. After, cultures were evaluated for fungicidal activity, H2O2 and NO release and expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA by real-time RT-PCR. The concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 on supernatants of cocultures were evaluated by ELISA. Our results provided evidence that human monocytes challenged with both strains of P. brasiliensis release prostaglandins that via induction of IL-10 and IL-6 inhibits TNF-α production. This process results in defective cell activation with consequent release of low H2O2 levels and lack of fungicidal activity by cells. However the inhibitory effect of PGs may be... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Luciene Alarcão Dias Melicio / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: João pessoa Araújo Junior / Banca: Heloisa Blotta / Banca: Gil Bernard / Doutor