Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: O objetivo geral do trabalho foi caracterizar a produção de progesterona (P4) pelas células do corpo lúteo (CL) bovino submetidas a diferentes meios de cultivo e cocultivo in vitro. Para tanto foram realizados três experimentos descritos em dois artigos. No artigo I, CLs pertencentes à fase média (10-12 dias, n=5) foram coletados e processados em laboratório. As LCs foram cultivadas por 07 dias em atmosfera umida a 5% de CO2, com ou sem a adição de 10% de soro fetal bovino (SFB), com os respectivos tratamentos: CONTROLE; CONA (10 μg/mL); LH (100 μg/mL); CONALH; LHPGFβα (10 ng/mL); CONALHPGFβα. Amostras de meio de cultivo foram coletadas nos D1 e D7 para posterior dosagem de P4. Valores com P<0,05 foram considerados diferentes estatisticamente. O cultivo de LCs na presença de CONA diminuiu a capacidade secretória de P4 das LCs e este efeito foi revertido pela adição de LH no meio de cultivo no D1, mas não no D7. A ação supressora da CONA foi mais evidente no cultivo que não empregaram o SFB. No artigo II, No Exp. 1, foram utilizados CLs pertencentes à fase média (10-12 dias, n=4). No laboratório os CLs foram processados e as LCs foram cultivadas por 07 dias em atmosfera umida a 5% de CO2. As LCs receberam os respectivos tratamentos com ou sem LH: Controle; PGF2α (10 ng/mL); PGF2α (100 ng/mL); PGF2α (354,5 ng/mL). As amostras que receberam LH apresentaram maior produção de P4, e a administração de diferentes doses de PGFβα não mostrou alteração na secreção de P4. No Exp. β, for... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The general objective of this study was to characterize the production of progesterone (P4) by the cells of the bovine corpus luteum (CL) subjected to different culture and coculture media in vitro. To this end, three experiments described in two articles were conducted. Article I: CLs belonging to the middle phase (10-12 days, n=5) were collected and processed in the laboratory. The luteal cells (LCs) were cultured for 07 days in a humid atmosphere of 5% CO2, with or without the addition of 10% fetal bovine serum (FBS), with their respective treatments: CONTROL; CONA (concanavalin-A) (10 μg/mL); LH (100 μg/mL); CONALH; LHPGFβα (10 ng/mL); CONALHPGFβα. Samples of culture medium were collected on D1 and D7 for further P4 measurement. P values <0.05 were considered statistically different. Culture of LCs in the presence of CONA decreases the ability of LC to secrete P4, and this effect was reversed by addition of LH in the culture medium in D1, but not in D7. The suppressive action was more evident in CONA cultures without FBS. In Article II, Experiment 1, CLs of middle phase of the estrous cycle (10-12 days, n = 4) were used. In the laboratory, the CLs were processed and the LCs were cultured for 07 days in a humidified atmosphere of 5% CO2. The LCs received the respective treatments with or without LH (100 μg/mL): Control; PGFβα (10 ng/mL); PGFβα (100 ng/mL); PGFβα (354,5 ng/mL). The samples that received LH produced more P4, and the administration of different doses of PGFβα... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / It is well established that locally produced factors exert pivotal roles during dominant follicle selection, oocyte maturation, ovulation and luteolysis. However, the identification of these factors and pathways involved in these processes are not yet established. In the present study, we focused on the in vivo bovine models to study reproductive physiology, which were used to identify receptors and intracellular signaling pathways involved in follicle selection and luteolysis. In the first study, it was reviewed the in vivo models used in our lab, describing and discussing the different bovine models and techniques currently used to study ovarian physiology in this mono-ovulatory specie. In a second study, it was evaluated the expression of estrogen receptors (ESRs) before (day 2 of follicular wave), during (day 3) and after (day 4) follicular deviation in cattle. ESR1 and ESR2 transcripts levels were higher in dominant (F1) than subordinate (F2) follicle after follicular deviation. FSH treatment maintained mRNA levels of both ESR1 and ESR2 in F2 follicles at similar levels observed in F1 follicles. Intrafollicular injection of 100 μM fulvestrant (an antagonist of ESRs) inhibited follicular growth and decreased CYP19A1 mRNA levels. Transcript levels of both ESR1 and ESR2 were not affected by fulvestrant injection. In the third study, our objective was to demonstrate the role of the transcription factor signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and the nuclear receptor 5A2 (NR5A2) in luteolysis. Luteal and blood samples were collected from separate groups of cows on Day 10 of the estrous cycle 0, 2, 12, 24, and 48 hours after prostaglandin F2 alpha (PGF) treatment. Serum progesterone concentrations decreased (P < 0.05) within 2h and the histological examination of the corpus luteum at 24 and 48h after PGF treatment confirmed functional and morphological luteolysis, respectively. The abundance of STAR mRNA and protein decreased at 12h after PGF treatment. The abundance of NR5A2 mRNA and protein decreased (P < 0.05) at 12 and 24h post-PGF, respectively. Levels of STAT3 mRNA remained constant (P > 0.05) throughout the time-points evaluated. However, the abundance of phosphorylated isoform of STAT3, normalized to total STAT3, increased reaching a peak at 12h and remaining high until 48h after PGF treatment. In conclusion, bovine in vivo models provide a valuable system to study reproductive events under physiological endocrine environment while keeping intact the communication between follicular cells through autocrine and paracrine signaling, without the need to perform ovariectomy or euthanaze the animals. Our results suggest that both ESR1 and ESR2 are regulated during follicular deviation and dominance and in response to FSH treatment in cattle, ESRs are required for normal gene expression and development of the dominant follicle. PGF treatment results in decreased expression of the nuclear receptor NR5A2 and activation of STAT3 by phosphorylation in bovine luteal cells. / É bem estabelecido que fatores produzidos localmente exercem papel essencial durante a seleção do folículo dominante, maturação oocitária, ovulação e luteólise. No entanto, os fatores e vias envolvidas nestes processos não estão totalmente estabelecidos. No presente estudo, enfatizou-se o uso de modelos bovinos in vivo para o estudo da fisiologia reprodutiva, sendo aqui utilizados para identificar receptores e vias de sinalização intracelular envolvidas na seleção do folículo e luteólise. No primeiro estudo, revisaram-se os modelos in vivo utilizados em nosso laboratório, descreveram-se e discutiram-se os diferentes modelos em bovinos e técnicas atualmente utilizadas para estudar fisiologia ovariana nesta espécie monovulatória. Em um segundo estudo, avaliou-se a expressão de receptores de estradiol (ESRS) antes (dia 2 da onda folicular), durante (dia 3) e após (dia 4) a divergência folicular em bovinos. Os níveis dos transcritos ESR1 e ESR2 foram maiores no folículo dominante (F1) que no subordinado (F2) após a divergência folicular. O tratamento com FSH manteve os níveis de RNAm de ambos ESR1 e ESR2 nos folículos F2 em níveis semelhantes aos observados em folículos F1. A injeção intrafolicular de 100 uM de fulvestrant (um antagonista de ESRs) inibiu o crescimento folicular e causou uma diminuição dos níveis de RNAm de CYP19A1. Os níveis de transcritos, tanto para ESR1 e ESR2, não foram afetados pela injeção de fulvestrant. Num terceiro estudo, o nosso objetivo foi demonstrar o papel do Transdutor de sinais e ativador de transcrição 3 (STAT3) e do receptor nuclear 5A2 (NR5A2) na luteólise. Amostras de corpo lúteo (CL) e sangue foram coletadas dos grupos de vacas 0, 2, 12, 24 e 48 horas após o tratamento com prostaglandina F2 alpha (PGF) no dia 10 do ciclo estral. A concentração de progesterona sérica diminuiu (P < 0.05) em 2 horas e o exame histológico do CL às 24h e 48h após o tratamento com PGF confirmou a ocorrência de luteólise funcional e morfológica, respectivamente. A abundância de RNAm e proteína de STAR diminuiu às 12h após o tratamento com PGF. A abundância de RNAm e proteína de NR5A2 diminuiu (P < 0.05) às 12 e 24 horas pós-PGF, respectivamente. Os níveis de RNAm de STAT3 permaneceram constantes (P> 0.05) ao longo do tempo avaliado. No entanto, a abundância da isoforma fosforilada de STAT3, normalizados para STAT3 total, aumentou, atingindo um pico às 12h e permaneceu elevada até 48h após o tratamento com PGF. Em conclusão, os modelos bovinos in vivo fornecem um sistema valioso para estudar os eventos reprodutivos sob ambiente fisiológico, mantendo intacta a comunicação entre as células foliculares através de sinalização autócrina e parácrina, reduzindo a necessidade de realizar ovariectomia ou realizar a eutanásia dos animais. Nossos resultados sugerem que tanto ESR1 como ESR2 são regulados durante a divergência e dominância folicular em bovinos e em resposta ao tratamento com FSH, e ESRs são necessários para a expressão gênica e para o desenvolvimento do folículo dominante. O tratamento com PGF resulta em diminuição da expressão do receptor nuclear NR5A2 e ativação de STAT3 por fosforilação em células luteais bovinas.