Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Universiẗat, Diss., 2007--Frankfurt (Main). / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

Univ., Diss., 2010--Marburg.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Universiẗat, Diss., 2006--Marburg.

In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass Pycnogenol® aufgrund seiner antiinflammatorischen, antioxidativen, antihypertensiven und blutglucosesenkenden Eigenschaften Vorteile für Patienten mit Prädiabetes oder Typ 2 Diabetes als Ergänzung zur konventionellen antidiabetischen Medikation haben kann. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die bisher wenig erforschten molekularen Prozesse zu untersuchen und die für die beobachteten Effekte verantwortlichen Bestandteile bzw. Metabolite von Pycnogenol zu identifizieren. Oxidativer Stress spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Diabetes und diabetischen Komplikationen. Die bekannten Bestandteile und Metabolite des Kiefernrindenextraktes Protocatechusäure, Gallussäure, Kaffeesäure und M1 zeigten in in vitro Assays ein stärkeres antioxidatives Potential als Ascorbinsäure. Die perorale Einnahme des Extraktes über 5 Tage bewirkte bei 2 von 5 Probanden eine Verbesserung der antioxidativen Aktivität des Serums. Somit kann Pycnogenol dazu beitragen, das bei Diabetes-Patienten verminderte antioxidative Abwehrsystem zu stärken. Entzündungsprozesse treten als Folge von Insulinresistenz, Hyperglykämie und Hyperlipidämie auf. Daher wurde der Einfluss des Rindenextraktes auf die Sekretion von TNF- und die Aktivität der COX-Enzyme getestet, die bei Diabetes erhöht sind. Nach peroraler Einnahme von Pycnogenol war eine statistisch nicht signifikante Zunahme der TNF- Sekretion in Zellkulturüberständen humaner Monocyten nach Inkubation mit Serumproben festzustellen. Die antiinflamma-torischen Effekte sind somit nicht durch die Reduktion der TNF- Sekretion zu erklären. Des Weiteren wurde ein moderater inhibitorischer Effekt auf die Aktivität von COX-1 und COX-2 ex vivo verzeichnet. Die unselektive Hemmung der Enzyme ist mit klassischen NSAIDs vergleichbar. Da bereits 30 min nach Einnahme des Extraktes ein Hemmeffekt auf die enzymatische Aktivität ex vivo zu erkennen war, konnte auf eine schnelle Bioverfügbarkeit von biologisch aktiven Verbindungen aus Pycnogenol geschlossen werden. Die COX-Hemmung liefert somit eine partielle Erklärung für die in vivo beobachtete antiinflammatorische Aktivität und Hemmung der Thrombocytenaggregation durch den Extrakt. Chronische Hyperglykämie gilt als Leitbefund bei Diabetes mellitus. Es sind diverse Ansatzpunkte denkbar, um der Ursache Insulinresistenz entgegenzuwirken. Der Kiefernrindenextrakt erwies sich in vitro als 200-fach effektiver bei der Hemmung der -Glucosidase als Acarbose. Dabei wurden die tetrameren und höher oligomeren Procyanidine als aktive Substanzen identifiziert und die Reduktion der Enzymaktivität diesen zugeschrieben. Hierdurch kann eine Verlangsamung der Glucoseresorption und somit eine Vermeidung von postprandialen Glucosespitzen erzielt werden, wodurch die klinisch beobachtete antidiabetische Wirkung von Pycnogenol erklärt werden könnte. Des Weiteren wurde ein auf PPAR- spezifischer ELISA entwickelt, da bisher PPAR- nur indirekt durch Aktivitätsmessung von Reportergenen bestimmt wurde. Die Inkubation von humanen Monocyten mit M1 bzw. Rosiglitazon in deren jeweiligen Plasmakonzentrationen bewirkte eine geringfügige Zunahme der Konzentration des ligandenaktivierten und DNA-bindungsfähig gemachten PPAR- im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Eine durch den Metaboliten M1 bewirkte Aktivierung von PPAR-, die unter anderem zur Verbesserung der Sensitivität der Insulinrezeptoren führt, konnte hier nicht eindeutig nachgewiesen werden. Eine reduzierte Expression von GLUT-4 auf der Zelloberfläche ist an der Entstehung von Insulinresistenz beteiligt. Durchflusszytometrische Messungen zeigten, dass bei 24-stündiger Vorinkubation von Adipocyten Rosiglitazon wie auch M1 eine Zunahme der GLUT-4 Dichte im Vergleich zur Kontrolle bewirkten. M1 könnte somit durch Steigerung der Exocytose von GLUT-4 die Glucoseverwertung erhöhen und so die Blutglucosespiegel senken. Adipositas gilt als Risikofaktor für Diabetes mellitus und wird durch viele Antidiabetika begünstigt. Pycnogenol, (+)-Catechin, Ferulasäure, Protocatechusäure, (±)-Taxifolin, Fraktion I und M1 bewirkten in vitro eine Reduktion der intrazellulären Lipidakkumulation aufgrund der Hemmung der Adipogenese. Ob die im humanen Organismus erreichten Konzentrationen nach oraler Einnahme des Extraktes ausreichen, um die Adipocyten-Differenzierung signifikant zu hemmen, bleibt zu klären. Die Ergebnisse der vorliegenden ex vivo und in vitro Untersuchungen liefern einen Ansatz zur Erklärung der beobachteten klinischen Effekte auf molekularer Ebene. / In clinical trials it has been shown that Pycnogenol® might be advantageous for patients with Typ 2 diabetes in addition to a conventional antidiabetic medication due to its antiinflammatory, antioxidant, antihypertensive and blood glucose-lowering abilities. The aim of this study was to investigate the underlying molecular processes and to identify the compounds and metabolites of Pycnogenol responsible for the observed effects. Oxidative stress plays a pivotal role in the pathogenesis of diabetes and diabetic complications. The known compounds and metabolites of the pine bark extract protocatechuic acid, gallic acid, caffeic acid and M1 revealed a greater antioxidant potential than ascorbic acid in in vitro assays. Peroral intake of the extract for 5 days lead to an improvement of the antioxidant activity of serum in 2 of 5 volunteers. Thus, Pycnogenol could possibly contribute to a reinforcement of the reduced antioxidant body’s defense system in diabetic patients. Inflammatory processes are a consequence of insulin resistance, hyper¬glycemia and hyperlipidemia. Thus the influence of the pine bark extract on the secretion of TNF- and the activity of the COX-enzymes was tested, which are elevated in diabetes. After peroral intake of Pycnogenol a statistically non-significant increase in TNF- secretion in cell culture supernatants of human monocytes after incubation with serum samples was determined. Hence the antiinflammatory effects cannot be explained with the reduction of TNF- secretion. Furthermore a moderate inhibitory effect on the activity of COX-1 and COX-2 ex vivo was observed. The non-selective inhibition of the enzymes is comparable to classic NSAIDs. Since an inhibitory effect on the enzymatic activity was already detected after 30 min after intake of the extract, a fast bioavailibility of biologically active compounds from Pycnogenol was implied. The inhibition of COX provides a partial explanation for the antiinflammatory activity and inhibition of platelet aggregation by the extract observed in vivo. Chronic hyperglycemia is implicated in diabetes mellitus. Several approaches are feasible to counteract the underlying insulin resistance. The pine bark extract proved to be 200 times more effective in inhibiting -glucosidase in vitro than acarbose. The tetrameric and higher oligomeric procyanidines were identified as active compounds reducing the enzymatic activity most potently. This mechanism allows to slow down glucose resorption and thus prevent postprandial glucose peaks which would explain the clinically observed antidiabetic effect of Pycnogenol. Furthermore an ELISA specific to PPAR- was developed; until then PPAR- had only been determined by indirect measuring of reporter gene activity. The incubation of human monocytes with M1 and rosiglitazon, respectively, in their plasma concentrations resulted in a slight increase of the concentration of the ligand-activated and DNA-binding-enabled PPAR- in comparison to untreated cells. The activation of PPAR- by metabolite M1, which leads among others to an improved sensitivity of insulin receptors, could not be clearly verified. A reduced expression of GLUT-4 on the cell surface is implicated in the development of insulin resistance. Flow cytometric measurements revealed that the incubation of adipocytes with rosiglitazone as well as M1 for 24 h resulted in an increase of GLUT-4 density in comparison to the control. Thus, M1 might possibly increase glucose utilization by increasing the exocytosis of GLUT-4 and consequently lower blood glucose levels. Obesity is a risc factor for diabetes mellitus and is promoted by several antidiabetic drugs. Pycnogenol, (+)-catechin, ferulic acid, protocatechuic acid, (±)-taxifolin, fraction I and M1 evoked a reduction in intracellular lipid accumulation in vitro due to the inhibition of adipogenesis. It needs to be clarified if blood concentrations after oral intake of the extract are sufficient to inhibit adipocyt differentiation significantly in vivo. The results of the present ex vivo and in vitro investigations provide a basic approach to explain the clinically observed antidiabetic effects of Pycnogenol on molecular level.

Regensburg, Univ., Diss., 2002.

Univ., Diss., 2006--Frankfurt (Main) / Zsfassung in engl. und dt. Sprache

Eine erhöhte COX-2-Expression wird bei Krankheiten wie rheumatoider Arthritis aber auch Parkinson, Alzheimer und Krebs beobachtet. Die nichtinvasive Visualisierung und Quantifizierung der COX 2-Expression in vivo mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) könnte wertvolle Beiträge zur Diagnose dieser Krankheiten liefern. Zur Nutzung der PET-Technik werden geeignete COX-2-adressierende Radiotracer benötigt, deren Entwicklung auch die Identifizierung neuer, der Radiomarkierung zugänglicher COX-2-Inhibitoren als Leitstrukturen voraussetzt. Ziel dieser Arbeit war die Synthese von selektiven, der Radiomarkierung zugänglichen COX 2-Inhibitoren und deren In-vitro-Evaluierung, um Verbindungen zu identifizieren, die für eine weitere Entwicklung zu COX-2-adressierenden Radiotracern geeignet sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgehend von literaturbekannten COX-2-Inhibitoren zwei grundlegende Strategien verfolgt: die Derivatisierung an der Peripherie sowie der Austausch von Strukturelementen im Grundgerüst der COX-2-selektiven Inhibitoren. In dieser Arbeit wird zum einen die Synthese der Zielverbindungen (Diphenyl-substituierte Indol-, Pyrazolo[1,5-b]pyridazin-, 1,2-Dihydropyrrolo[3,2,1-hi]indol- und Pyrrolo[3,2,1-hi]indol-Derivate sowie 2-Carbaboranyl-substituierte Indol-Derivate) und deren strukturanalytische Charakterisierung vorgestellt. Es konnte die McMurry-Cyclisierung als neuer Zugang für die Synthese von Carbaboranyl-substituierten Verbindungen und 1,2-Dihydropyrrolo[3,2,1-hi]indol-Derivaten sowie die Dehydrogenierung mittels DDQ als neue Variante zur Synthese von Pyrrolo[3,2,1-hi]indol-Derivaten etabliert werden. Durch Röntgeneinkristallstrukturanalyse wurde die Molekülstruktur von sechs Zwischenverbindungen und neun Zielverbindungen aufgeklärt. Zum anderen erfolgte die Charakterisierung der Verbindungen in vitro, wobei die COX-inhibitorischen Eigenschaften mit einem Fluoreszenz-basierten, einem Enzymimmunoassay (EIA)-basierten und einem [14C]Arachidonsäure-basierten COX-Assay bestimmt und zudem viele Verbindungen hinsichtlich ihrer Redoxeigenschaften untersucht wurden. Im Besonderen die hergestellten Indol-Derivate besitzen antioxidative Eigenschaften, die bei der Untersuchung der COX inhibitorischen Eigenschaften beachtet werden müssen. Die Derivatisierung an der Peripherie der bekannten Inhibitoren führte zur Identifizierung von zwei Aminosulfonyl-substituierten Indol-Derivaten und einem Fluorethoxy-substituierten Pyrazolo[1,5 b]pyridazin-Derivat, die grundsätzlich geeignete Kandidaten für eine weitere Entwicklung zum Radiotracer darstellen. Das Fluorethoxy-substituierte Pyrazolo[1,5 b]pyridazin-Derivat wurde im Rahmen dieser Arbeit mit Fluor-18 markiert und die initiale Charakterisierung des Radiotracers in vitro durchgeführt. Der Austausch von Strukturelementen im Grundgerüst der literaturbekannten COX-2-Inhibitoren mit voluminöseren Gruppen führte zum einen bei Austausch eines Phenylrings gegen einen Carbaboranyl-Cluster zum Verlust der COX-inhibitorischen Eigenschaften, was eine weitere Entwicklung dieser Verbindungen zum Radiotracer ausschließt. Zum anderen wurde ausgehend von 2,3-Diphenyl-1H-indol-Derivaten die bicyclische auf eine tricyclische Kernstruktur vergrößert. Dies lieferte hoch affine und selektive COX-2-Inhibitoren. Unter den hergestellten Verbindungen wurden ein 1,2-Dihydropyrrolo[3,2,1-hi]indol- und drei Pyrrolo[3,2,1-hi]indol-Derivate als vielversprechende Kandidaten für die weitere Entwicklung zum Radiotracer identifiziert.

Eine erhöhte COX-2-Expression wird bei Krankheiten wie rheumatoider Arthritis aber auch Parkinson, Alzheimer und Krebs beobachtet. Die nichtinvasive Visualisierung und Quantifizierung der COX 2-Expression in vivo mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) könnte wertvolle Beiträge zur Diagnose dieser Krankheiten liefern. Zur Nutzung der PET-Technik werden geeignete COX-2-adressierende Radiotracer benötigt, deren Entwicklung auch die Identifizierung neuer, der Radiomarkierung zugänglicher COX-2-Inhibitoren als Leitstrukturen voraussetzt. Ziel dieser Arbeit war die Synthese von selektiven, der Radiomarkierung zugänglichen COX 2-Inhibitoren und deren In-vitro-Evaluierung, um Verbindungen zu identifizieren, die für eine weitere Entwicklung zu COX-2-adressierenden Radiotracern geeignet sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgehend von literaturbekannten COX-2-Inhibitoren zwei grundlegende Strategien verfolgt: die Derivatisierung an der Peripherie sowie der Austausch von Strukturelementen im Grundgerüst der COX-2-selektiven Inhibitoren. In dieser Arbeit wird zum einen die Synthese der Zielverbindungen (Diphenyl-substituierte Indol-, Pyrazolo[1,5-b]pyridazin-, 1,2-Dihydropyrrolo[3,2,1-hi]indol- und Pyrrolo[3,2,1-hi]indol-Derivate sowie 2-Carbaboranyl-substituierte Indol-Derivate) und deren strukturanalytische Charakterisierung vorgestellt. Es konnte die McMurry-Cyclisierung als neuer Zugang für die Synthese von Carbaboranyl-substituierten Verbindungen und 1,2-Dihydropyrrolo[3,2,1-hi]indol-Derivaten sowie die Dehydrogenierung mittels DDQ als neue Variante zur Synthese von Pyrrolo[3,2,1-hi]indol-Derivaten etabliert werden. Durch Röntgeneinkristallstrukturanalyse wurde die Molekülstruktur von sechs Zwischenverbindungen und neun Zielverbindungen aufgeklärt. Zum anderen erfolgte die Charakterisierung der Verbindungen in vitro, wobei die COX-inhibitorischen Eigenschaften mit einem Fluoreszenz-basierten, einem Enzymimmunoassay (EIA)-basierten und einem [14C]Arachidonsäure-basierten COX-Assay bestimmt und zudem viele Verbindungen hinsichtlich ihrer Redoxeigenschaften untersucht wurden. Im Besonderen die hergestellten Indol-Derivate besitzen antioxidative Eigenschaften, die bei der Untersuchung der COX inhibitorischen Eigenschaften beachtet werden müssen. Die Derivatisierung an der Peripherie der bekannten Inhibitoren führte zur Identifizierung von zwei Aminosulfonyl-substituierten Indol-Derivaten und einem Fluorethoxy-substituierten Pyrazolo[1,5 b]pyridazin-Derivat, die grundsätzlich geeignete Kandidaten für eine weitere Entwicklung zum Radiotracer darstellen. Das Fluorethoxy-substituierte Pyrazolo[1,5 b]pyridazin-Derivat wurde im Rahmen dieser Arbeit mit Fluor-18 markiert und die initiale Charakterisierung des Radiotracers in vitro durchgeführt. Der Austausch von Strukturelementen im Grundgerüst der literaturbekannten COX-2-Inhibitoren mit voluminöseren Gruppen führte zum einen bei Austausch eines Phenylrings gegen einen Carbaboranyl-Cluster zum Verlust der COX-inhibitorischen Eigenschaften, was eine weitere Entwicklung dieser Verbindungen zum Radiotracer ausschließt. Zum anderen wurde ausgehend von 2,3-Diphenyl-1H-indol-Derivaten die bicyclische auf eine tricyclische Kernstruktur vergrößert. Dies lieferte hoch affine und selektive COX-2-Inhibitoren. Unter den hergestellten Verbindungen wurden ein 1,2-Dihydropyrrolo[3,2,1-hi]indol- und drei Pyrrolo[3,2,1-hi]indol-Derivate als vielversprechende Kandidaten für die weitere Entwicklung zum Radiotracer identifiziert.