Lors de la réponse immunitaire de la drosophile, la voie Toll est activée lors d'un challenge immunitaire par des bactéries à Gram positif ou des champignons. Ce mécanisme est initié soit par la reconnaissance de motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) qui activent la voie de reconnaissance, soit par des facteurs de virulence et des protéases produits par les agents pathogènes qui activent la voie des signaux de danger. Le travail que j'ai effectué a pour but de caractériser les différentes molécules impliquées dans ces cascades protéolytiques en amont de Toll. Cela permettra de reconstituer ces cascades in vitro et de comprendre comment elles sont organisées, comment et où des complexes peuvent être formés. La première partie concerne les approches génétiques utilisées pour générer des mutants des gènes pouvant être impliqués dans l'activation de la voie Toll par la voie des PAMPs. La deuxième partie se concentre sur un homologue inactif de protéase à sérine appelé spheroide et sur son implication dans la voie de reconnaissance des signaux de danger. Pour la première fois, nous avons pu démontrer qu'une protéase inactive est requise dans la cascade protéolytique, et plus particulièrement dans la détection des signaux de danger après un challenge immunitaire par des bactéries pathogènes à Gram positif. / The Toll pathway in Drosophila immune response is activated upon immune challenge with Gram positive bacteria and fungi. This can be achieved either through recognition of Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs), which triggers the recognition cascade; or by virulence factors and proteases produced by the pathogens, which triggers the danger signal cascade. The work I have done aimed to characterize the various molecules involved in proteolytic cascade supstream of Toll. This will help to reconstitute these cascades in vitro and understand how they are organized, how and where complexes could be formed. The first part focuses on genetic approaches used to generate mutants for genes suggested to be involved in the activation of Toll pathway via the recognition cascade. The second part focuses on an inactive serine protease, aserine protease homolog spheroide and its involvement in the danger signal cascade. For the first time, we could demonstrate that an inactive protease is required in the proteolytic cascade,involved in the sensing of danger signais upon immune challenge with pathogenic Gram-positive bacteria.

La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une obstruction des voies respiratoires, des infections et une inflammation pulmonaire résultant du recrutement massif de neutrophiles qui sécrètent des protéases : l’élastase, la protéase 3 et la cathepsine G. Ces protéases peuvent être sécrétées selon deux voies, la dégranulation ou la sécrétion de NETs (Neutrophil Extracellular Traps), qui sont des fibres de chromatine auxquelles elles sont associées et décrites comme des structures antimicrobiennes. Dans le milieu extracellulaire, la dérégulation du contrôle de l’activité des protéases par leurs inhibiteurs conduit à la dégradation progressive du tissu pulmonaire. Nous avons montré que cette dérégulation était modulée par l’interaction des protéases avec l’ADN présent dans les sécrétions bronchiques des patients et que le ciblage de ces protéases par des inhibiteurs exogènes pouvait être amélioré in vitro par de la DNase ou de la polylysine qui compacte l’ADN. Ce polypeptide est également bactéricide vis-à-vis des pathogènes majeurs de la mucoviscidose, S. aureus et P. aeruginosa. Nos travaux montrent également que les NETs sont sécrétés dans les poumons des patients où ils constituent un réservoir de protéases actives potentiellement délétère et n’ont pas d’effet bactéricide vis-à-vis de S. aureus et P. aeruginosa. Nos travaux montrent que les voies de signalisation conduisant à la sécrétion des NETs varient selon le stimulus, générant des structures aux propriétés différentes. / Cystic fibrosis (CF) is a hereditary disease characterized by the obstruction of the airways, infections and a chronic lung inflammation due to a massive recruitment of neutrophils that secrete proteases: the elastase, the proteinase 3 and the cathepsin G. These proteases can be secreted by two mechanisms, namely degranulation and the secretion of NETs (Neutrophil Extracellular Traps), which are chromatin fibers to which they are bound and that have been described as antimicrobial structures. In the extracellular environment, the dysregulation of these proteases control by their inhibitors leads to progressive lung tissue degradation. We have shown that this dysregulation was influenced by the interaction of the proteases with the DNA found in the lung secretions of CF patients and that targeting these proteases with exogenous inhibitors could be improved in vitro by DNase or polylysine, which compacts DNA. This polypeptide also presents a bactericidal effect towards the major CF-associated pathogens, S. aureus and P. aeruginosa. Our work also shows that NETs are secreted in the lungs of CF patients, where they are a potentially deleterious reservoir of active proteases, and that they do not display any bactericidal effect towards S. aureus and P. aeruginosa. Our work shows that the signalization pathways leading to NETs secretion vary depending on the stimulus, generating structures that present different properties.

Ce projet porte sur la synthèse d'oligonucléotides modifiés décorés par des groupements chimiques rappelant les chaines latérales des acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des protéases à sérine, à savoir l'acide aspartique (Asp), la sérine (Ser) et l'histidine (His) afin d'en mimer l'activité protéolytique. L'approche synthétique de type phosphoramidite a été mise en oeuvre. De ce fait nous avons synthétisé des phosphoramidites fonctionnalisés avec une fonction acide carboxylique rappelant l'Asp, une fonction hydroxyle pour la Ser ou un imidazole pour l'His, correctement protégés pour être ensuite incorporés au sein de séquences oligonucléotidiques, et des phosphoramidites convertibles, qui portent une fonction chimique réactive permettant une conjugaison post synthèse supportée et automatisée de l'oligonucléotide. Ces deux types de phosphoramidites offrent la possibilité de les combiner et donc d'obtenir des séquences hautement fonctionnalisées. Les séquences oligonucléotidiques ont été choisies afin d'apporter un contrôle topologique structurant. Les structures secondaires envisagées sont de type bulge, épingle à cheveux et jonction trois voies car stables grâce aux appariements Watson et Crick entre les bases tout en ayant une flexibilité importante due à la présence de bases non appariées. Les travaux présentés dans ce manuscrit décrivent la synthèse des phosphoramidites modifiés ainsi que l'incorporation du nucléotide convertible de type alcyne au sein de séquences qui ont été conjuguées par CuAAC, et qui ont permi d'obtenir une jonction trois voies qui a été caractérisée par dichroïsme circulaire, gel de polyacrylamide et par dénaturation thermique. / We are interested in the synthesis of modified oligonucleotides decorated by chemical fonctions mimicking the amino acids side chains involved in enzymatic catalysis of serine proteases, acid aspartic (Asp), serine (Ser) and histidine (His), in order to mimic proteolytic activity. The phosphoramidite synthetic approach was choosen. We synthesised functionnalized phosphoramidites bearing either a carboxylic acid function reminding Asp, a hydroxyle function for Ser or an imidazole for His properly protected for their incorporation in oligonucleotides sequences, and convertible phosphoramidites, bearing a reactive function that permits a conjugation post automated oligonucleotides solid phase synthesis. Oligonucleotides sequences have been choosen in order to have a perfect structural control. The envisaged secondary structures are bulge, hairpin and three way junction because of their stability, thanks to Watson et Crick base pairing, and their flexibility thanks to the unpaired bases. The work presented here regards the synthesis of modified phosphoramidites and their incorporation of the convertible alkyne in sequences then conjugated by CuAAC reaction to form a three way junction whose stability and physico-chemical behavior have been evaluated.