L’amyotrophie spinale (SMA) est causée par une réduction du taux de la protéine de Survie des MotoNeurones (SMN). Cette protéine est associée aux protéines Gemin 2 à Gemin 8 et unrip pour former le complexe SMN. Bien que la protéine SMN soit présente dans tous les types cellulaires, la pathologie SMA est exclusivement liée à un défaut des motoneurones. Récemment, il a été proposé que SMN puisse avoir des fonctions spécifiques dans le transport des ARNm et dans la régulation de la traduction dans les neurones. La protéine FMRP, défective dans le syndrome de l’X fragile, joue également un rôle dans le transport de particules messagères (mRNP) et dans leur traduction. Dans cette étude, nous avons mis en évidence un lien entre le complexe SMN et la protéine FMRP dans les cellules neuronales suggérant un rôle du complexe SMN dans ces mécanismes. Les connaissances sur la composition, les interactions et les fonctions du complexe SMN ont bien avancées ces dernières années. L’idée actuelle est que le complexe SMN agirait comme un chaperon macromoléculaire des RNP en augmentant l'efficacité et la fidélité des interactions ARN-protéines et en fournissant l’opportunité à ces interactions d’être régulées. Le deuxième volet de cette étude a été d’analyser l’implication du complexe SMN dans l’assemblage de RNP différentes des UsnRNP. Le défaut spécifique des motoneurones nous a conduit à considérer le rôle du complexe SMN dans l’assemblage de RNP spécifiques à ce type cellulaire et notamment la RNP BC200. Finalement, nous nous sommes également intéressé à l’implication du complexe SMN dans l’assemblage et/ou la fonction de la particule SRP, une particule ubiquitaire. / Spinal muscular atrophy (SMA) is caused by reduced levels of the survival of motor neuron (SMN) protein. SMN protein is associated with the proteins Gemin 2 to 8 and unrip to form the SMN complex. Although the SMN protein is present in all cell types, SMA is restricted to a defect in motor neuron. SMN was recently proposed to have specific functions in mRNA transport and translation regulation in neuronal processes. The defective protein in Fragile X mental retardation syndrome (FMRP) also plays a role in transport of mRNPs and in their translation. In this study, we showed a link between the SMN complex and FMRP in neuronal cells suggesting a role for the SMN complex in these processes. Knowledges of the composition, interactions and functions of the SMN complex have advanced greatly in recent years. The emerging picture is that the SMN complex acts as a macromolecular chaperone of RNPs to increase the efficiency and fidelity of RNA–protein interactions, and to provide an opportunity for these interactions to be regulated. The second part of this study was to analyse the involvement of the SMN complex in the biogenesis of RNP different of UsnRNP. The specific defect of motor neuron led us to analyse the role of the SMN complex in the biogenesis of specific RNP to this cell types in particular the RNP BC200. Finally, we are also interested to the SMN complex involvement in the assembly and/or the function of the SRP particle, an ubiquitous particle.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / L’anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare due à un défaut de réparation de l’ADN au niveau des pontages inter-brins. La protéine FANCG est impliquée, avec 15 autres protéines, dans cette réparation via la voie de Fanconi. En plus de ce rôle, FANCG a été identifié comme faisant partie du complexe B2D2GX3. Néanmoins, le rôle exact de ce complexe reste à être élucidé. Cette étude a permis de mettre en évidence de nouveaux interacteurs de FANCG, connus pour être impliqués dans diverses voies de réparation de l’ADN et dans le choix de la voie de réparation à utiliser. Ainsi, nous posons l’hypothèse que FANCG possède des fonctions additionnelles, via ces nouveaux partenaires. Les données recueillies montrent qu’indépendamment de son rôle dans la voie de Fanconi, et bien que ne liant pas l’ADN, FANCG est recruté aux sites de dommages à l’ADN et permet d’engendrer sa réparation.

Le travail présenté dans cette étude a été réalisé au laboratoire du Dr. Luca Pellegrini, qui se concentre sur les mécanismes régulant la dynamique mitochondriale. Dans ce contexte, mon travail s'est focalisé sur la protease rhomboïde Parl, un régulateur essentiel de l'apoptose, de la morphologie mitochondriale et du métabolisme et qui a été impliquée dans la maladie de Parkinson. Au cours de ce travail, nous avons adopté une approche en deux points pour comprendre les bases structurelles et mécanistiques de l'activité protéolytique de Pari et de sa régulation. Dans une première approche, nous avons réalisé une analyse de la structurefonction basée sur un modèle d'homologie pour identifier les déterminants structurels de Pari. L'identification d'un événement de coupure protéique (clivage- Y) qui génère une nouvelle forme de Pari présentant une structure à six segments transmembranaires à partir de la structure classique à 6+1 segments transmembranaires nous a servi de base pour cette étude. Nos résultats montrent des similarités de structure entre la protéine rhomboïde d'origine bactérienne GlpG and Pari. Cependant, Pari semble utiliser une catalyse par triade par opposition à la catalyse par dyade opérée par les rhomboïdes GlpG. Le clivage y perturbe la triade et rend ainsi Pari protéolytiquement inactif. Ainsi, notre étude a identifiée la régulation de la fonction de Pari par l'élimination protéolytique de son activité, ce que nous avons publié dans le journal Cell Death & Differentiation. Dans une seconde approche, nous nous sommes penché sur la validité d'un communiqué publié dans Nature (Chao et al., 2008) qui suppose un rôle pour la protéine HAX1 en tant que protéine présentatrice de substrat pour Pari. En effet, plusieurs faisceaux de preuves n'étaient pas cohérents avec les résultats de cette étude. Nos résultats montrent que Pari et HAX1 sont confinés dans des souscompartiments cellulaires distincts et que l'interaction observée in vitro n'est qu'un artefact. Ainsi in vivo, HAX1 ne peut pas contribuer à la régulation de la protéolyse 2opérée par Pari. Notre étude a contesté les résultats de Chao et al., et a été publiée dans un article de fond dans le journal Cell Death & Differentiation. Enfin, il est important de mentionner qu'au cours de mon doctorat j'ai été le coauteur d'une revue (Jeyaraju et al., BBA 2009) et de deux articles de recherche à travers des collaborations avec les laboratoires du Dr Toth (Lavoie et al., J.Neuroscience, 2011 ) et du Dr Shore (Warr et al., JBC, 2011 ).

L’épissage alternatif en 3’ du gène UGT1A entraîne la production d’enzymes actives, les isoformes 1 (i1), et de protéines tronquées, les isoformes 2 (i2), qui ne possèdent pas de domaine transmembranaire (TMD) et d’activité de glucuronidation, mais plutôt des propriétés modulatrices sur l’activité enzymatique des i1 via des interactions protéiques. Nous croyons que les interactions i1-i2 impliquent plusieurs domaines d’interactions et qu’ils sont différents de ceux impliqués dans l’homo-oligomérisation des i1. Des expériences de co-immunoprécipitation démontrent que les isoformes i1 dépourvues du signal peptide +/- le TMD empêchent l’homo-oligomérisation sans affecter l’interaction i1-i2. De plus, la présence de complexes de hauts poids moléculaires observée par immunobuvardages en conditions non-réductrices démontre l’implication potentielle de ponts disulfures dans la formation des complexes i1-i2, et ce via plusieurs résidus cystéines. En somme, les résultats obtenus supportent que l’interaction i1-i2 implique plusieurs domaines protéiques et qu’ils diffèrent de ceux impliqués dans les complexes i1-i1. / Alternative splicing of UDP-glucuronosyltranferase UGT1A gene results in the production of enzyme, isoforms i1 and i2. Unlike the active i1 proteins, i2 are truncated proteins which lack the transmembrane domain and glucuronic acid transferase activity, but have an inhibitory effect on UGT1A activity likely through the formation of hetero-oligomers with i1. We believe that i1-i2 interaction involves binding of more than one domain. Our results showed that i1, in the presence or absence of the transmembrane domain, without the signal peptide did not self-interact but instead interacted with i2. In addition, high molecular weight complexes were observed by immunoblotting under non-reducing conditions. It demonstrates the involvement of disulfide bonds in the formation of i1-i2 complexes. In summary, these results support that i1-i2 interactions involve multiple protein domains and they differ from those involved in homo-oligomerization of i1.

Le Ca[exposant]2+ joue un rôle majeur dans la régulation de processus physiologiques et biochimiques de l'organisme. Chez les cellules non-excitables, les TRPCs (transient receptor potential canonical) sont des canaux calciques impliqués dans l'influx de Ca[exposant]2+ à la membrane plasmique. Bien que de nombreux efforts soient déployés, le mécanisme régulant l'activité et le routage des TRPCs est encore mal connu. Au cours des dernières années, l'étude de domaines conservés au sein des protéines a connu un engouement. Tous les TRPCs possèdent un domaine de répétitions similaires à l'ankyrine (ANK), un motif bien connu pour son implication dans des interactions protéine-protéine. Le but de la présente étude était d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction du domaine ANK des TRPCs. Pour ce faire, nous avons utilisé l'approche de double-hybride chez la levure afin de cribler une librairie d'ADNc, ce qui nous a permis d'identifier MxA et RNF24. MxA est une protéine faisant partie de la superfamille de la dynamine. Elle possède plusieurs propriétés de la dynamine classique, dont celle d'oligomériser. La première partie de l'étude démontre que MxA interagit au niveau de la deuxième répétition similaire à l'ankyrine de TRPC6 et que cette protéine peut lier tour les TRPCs, autant in vitro qu'in cellulo. Des mesures de Ca[exposant]2+ intracellulaire effectuées sur des cellules HEK 293T démontrent que l'interaction entre MxA et TRPC6 modifie significativement l'activité de TRPC6. De plus, l'utilisation de mutants de MxA démontre que la modulation de l'activité de TRPC6 s'effectue lorsque MxA est sous sa forme monomérique liée au GTP. Les résultats démontrent que MxA lie le domaine ANK de TRPC6 et modifie son activité. La découverte de RNF24 a permis d'identifier une nouvelle protéine membranaire localisée au niveau de l'appareil de Golgi. L'expression de RNF24 réduit spécifiquement l'insertion des TRPCs a la membrane plasmique, cause une rétention intracellulaire des TRPC3 et TRPC6, mais n'affecte pas le processus de maturation de TRPC6. De plus, dans les cellules HEK 293T stimulées par le carbachol, l'influx de Ca[exposant]2+ endogène ou médié par TRPC6 n'est pas affecté par la co-expression de RNF24. Ainsi, les résultats démontrent que RNF24 interagit avec les TRPCs, affecte le routage intracellulaire de ceux-ci sans modifier leur activité. Ces deux études ont permis d'identifier les premiers partenaires d'interaction du domaine ANK des TRPCs, soit MxA et RNF24, et de caractériser l'effet des interactions sur la modulation du routage et de l'activité des TRPCs.

Le terme de sulfoprotéomique est utilisé pour désigner l’étude de la sulfatation des protéines. Bien que la sulfatation soit depuis peu considérée comme une MPT d’une importance majeure, il y a toujours peu de travaux scientifiques qui y sont consacrés en comparaison avec ce qui se fait sur la phosphorylation notamment. Ce retard s’explique notamment par la difficulté à analyser les espèces protéiques sulfatées dans les conditions classiques utilisées en protéomique, notamment par spectrométrie de masse. Ces travaux de thèse visent justement à développer des méthodes d’analyses par spectrométrie de masse dédiées à l’étude de la sulfatation des protéines, afin d’augmenter le champ des connaissances de cette MPT. Pour cela, nous avons largement utilisé le mode d’ionisation négatif, très peu, voire jamais utilisé en protéomique, avec deux techniques de fragmentation pour réaliser des spectres MS/MS, à savoir les fragmentations CID et HCD. Les résultats obtenus nous ont permis de mettre en évidence une méthode d’analyse permettant la formation d’ions spécifiques de la sulfatation et de la phosphorylation (qui sont isobariques), permettant ainsi une identification certaine de chacune des deux MPTs. Nous avons également entrepris d’étudier le rôle de la sulfatation d’un récepteur cellulaire, CXCR4, dans son interaction avec son ligand naturel, la chimiokine SDF-1/CXCL12. Cette étude a été menée par électrophorèse capillaire, et pourra constituer une base de travail solide pour des futures analyses mettant en œuvre le couplage entre l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse pour une meilleure caractérisation des complexes formés entre les partenaires protéiques. / Sulfoproteomics term designs protein sulfation studies. It appears during the 2000’s, when the interest for others Post-Translational Modifications (PTMs) than phosphorylation and glycosylation was growing up. Even though sulfation is thought to be an important PTM, a weak number of publications has emerged about it, notably if we compare with the huge quantity of phosphorylation papers. This difference is mainly due to the difficulty to correctly analyze sulfated proteins and peptides in the classical ways of proteomics, as in mass spectrometry for example. The goal of this thesis is to develop mass spectrometry methods dedicated to the characterization of sulfated species, in order to improve the knowledge of this PTM. To do that, we have mainly used negative ion mode, which is almost never used, with two fragmentations techniques for the MS/MS spectra, which are CID and HCD. Results obtained allow us to pinpoint an analytical method allowing the differentiation between sulfation and phosphorylation (they are isobaric), based on the presence of specific ion for each PTM in MS/MS. In another part of the project, we have investigated the role of sulfation in the interaction between a cellular receptor, CXCR4, and its in vivo ligand, the chemokine SDF-1/CXCL12. We used capillary electrophoresis for this work, and it could be a good basis for future analyses using capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry, in order to have a better characterization of the observed complexes.

La ribonucléase III humaine Dicer est responsable de la biosynthèse des microARN et représente un pilier de la régulation génique, et donc de l’homéostasie cellulaire. Les microARN sont de petits éléments régulateurs de 19 à 24 nt qui régulent ~60% des gènes chez l’humain et sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires. De ce fait, il n’est pas étonnant qu’il y ait, dans la majorité des cancers, une diminution globale du niveau des microARN et que, dans plusieurs cas, un changement d’expression ou de localisation de la protéine Dicer ait été noté. Malgré le rôle important que joue Dicer dans la cellule, sa régulation n’est pas très bien connue, ni même les complexes de nature protéique au sein duquel il se trouve. Pour pallier à ce manque, nous avons criblé une librairie d’ADN complémentaires par double-hybride chez la levure, ce qui nous a permis de découvrir, et de caractériser, de nouvelles protéines pouvant interagir avec Dicer. Les résultats obtenus démontrent que Dicer est stabilisé par son interaction avec la protéine résidente du réticulum endoplasmique (RE) cytoskeleton-linking endoplasmic réticulum (ER) membrane protein of 63 kDa (CLIMP-63). La protéine Dicer forme un complexe avec CLIMP-63 peu de temps après sa traduction de novo. Les protéines semblent interagir à l’intérieur du RE et mener à l’export de la protéine Dicer hors de la cellule. Durant la mitose, où les niveaux de protéines Dicer sont réduits, Dicer peut être acétylé par l’acétyl-transférase General Control of Amino-acid Synthesis 5 (GCN5), une modification qui semble stabiliser Dicer. La localisation nucléaire de Dicer peut être causée par la protéine Mitogen-activated protein kinase upstream kinase-binding inhibitory protein (MBIP), au cours d’un processus nécessitant une lysine acétylable à la position 301 du signal de localisation nucléaire de MBIP. Finalement, la cytokine (TWEAK) pourrait moduler l’activité de clivage de Dicer via une interaction directe entre les deux protéines. L’utilisation du double-hybride chez la levure a permis de jeter un éclairage nouveau sur les protéines pouvant réguler la fonction et la localisation de l’enzyme Dicer dans les cellules humaines, au-delà de sa simple activité catalytique.

Un des défis de l’ère post-génomique est de déterminer la fonction des protéines et plus précisément d’établir une cartographie protéomique de la cellule. Ainsi le défi de la génomique fonctionnelle et plus précisément de la protéomique est de comprendre les événements qui ont lieu au cours de la maturation des protéines. Plusieurs approches ont été décrites pour comprendre la fonction des protéines dont les interactions protéiques. Traditionnellement, les études des interactions protéiques étaient basées sur des approches ciblées ou sur des hypothèses d’interactions. Récemment, le développement des analyses à haut débit a généré une quantité impressionnante d’information. Face à l’accumulation des données, une approche uniquement expérimentale n’apparaît plus suffisante. Par conséquent, la création de méthodes bioinformatiques développant des procédures de prospection de données couplées avec des approches expérimentales permettra de prédire les interacteurs in silico. C’est dans cette optique que le laboratoire a développé son projet de recherche sur la famille des poly (ADP-ribose) polymérases (PARPs). La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle qui consiste en l’ajout d’une chaîne d’ADP-ribose sur des protéines cibles.L’objectif principal de notre étude est de caractériser par des expériences d’immunoprécipitation le rôle dynamique de la poly(ADP-ribosyl)ation. L’identification des interacteurs des PARPs s’effectuera par spectrométrie de masse. Cette technique va générer d’importantes quantités de données et nécessitera une plate-forme d’analyse et de grandes capacités de calcul informatique. Dans ce contexte général, l’objectif de ce travail de thèse était de développer la plateforme bioinformatique d’analyse, d’implémenter les outils d’identifications des protéines, d’établir un contrôle de qualité des méthodes d’identification (spécificité/sensibilité) et enfin d’explorer le contenu des bases de connaissances. A l’aide du système mis en place au sein de la plateforme de protéomique, nous avons identifié de nouvaux interacteurs de la famille des PARPs comme par exemple RFC1, 2, 3, 4, 5. / An ambitious goal of proteomics is to elucidate the structure, interactions and functions of all proteins within cells and organisms. In the “post-genome” era, mass spectrometry (MS) has become an important method for the analysis of proteome data. One strategy to determine protein function is to identify protein–protein interactions. The rapid advances made in mass spectrometry in combination with other methods used in proteomics results in an increasing of proteomics projects. The increasing use of high-throughput and large-scale bioinformatics-based studies has generated a massive amount of data stored in a number of different databases. A challenge for bioinformatics is to explore array of information to uncover biologically relevant interactions and pathways. Thus for protein interaction studies, there is clearly a need to develop a systematic and stepwise in silico approach that can predict potential interactors or are most likely to improve our understanding of how complex biological systems work. The focus of our laboratory is the study of the activity of poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) and their role in the cell. Poly(ADP-ribosylation) is a post-synthetic protein modification consisting of long chains of poly(ADP-ribose) (pADPr) synthesized by PARPs at the expense of NAD+. The overall objective of this research is to extensively characterize the dynamic roles of poly(ADP-ribosyl)ation in response to cellular stresses that cause DNA damage. Our approach utilizes immunoprecipitation and affinity purification followed by mass spectrometry identification of associated proteins. One part of this thesis projet is to develop the architecture and major features of a web-based utility tool, which is designed to rationally organize protein and peptide data generated by the tandem mass spectrometry. Next, we have performed benchmarking to optimize protein identification. The system will be expanded as needed in order to make the analysis more efficient. We have also explored the public database information for protein identification data mining. Using the described pipeline, we have successfully identified several interactions of biological significance between PARP and other proteins such as RFC1, 2, 3, 4, 5.

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de HMGB1 et son récepteur RAGE dans l'étiopathogenèse des maladies parodontales. Nos résultats montrent que les macrophages de la lignée U937 sécrètent HMGB1 suite à une stimulation avec les lipopolysaccharides des bactéries parodontopathogènes, alors que son niveau intracellulaire demeure inchangé. Le récepteur RAGE est faiblement exprimé par cette lignée et sa forme membranaire reste inchangée suite à ces stimulations alors que sa forme soluble est indétectable. De plus, la protéine HMGB1 n'induit pas la production des cytokines pro-inflammatoires TNF-a et IL-1ß par les macrophages U937 et la neutralisation de HMGB1 et de RAGE n'affecte pas la sécrétion de ces cytokines. D'autre part, le dosage du HMGB1 plasmatique révèle un taux plus élevé chez les patients atteints de parodontites que chez les sujets sains. Cette étude a permis d'analyser l'induction de la sécrétion de HMGB1 et de RAGE par les lipopolysaccharides des parodontopathogènes.

La duplication de gènes est l’un des plus importants mécanismes évolutifs pour la génération de diversité fonctionelle. Lorsqu’un gène est dupliqué, la nouvelle copie partage toutes ses fonctions avec la copie ancestrale car elles encodent pour des protéines identiques. Donc, les deux protéines, appelées paralogues, auront le même réseau d’interactions physiques protéine-protéine. Cependant, dans le cas de la duplication des gènes qui codent des protéines qui interagissent avec elles-mêmes (homomères), la nouvelle protéine interagira aussi avec la copie ancestrale, ce qui introduit une nouvelle interaction (heteromère) (Kaltenegger and Ober, 2015; Pereira-Leal et al., 2007). Puisque ces interactions peuvent avoir des différents motifs de rétention et de fonction (Ashenberg et al., 2011; Baker et al., 2013; Boncoeur et al., 2012; Bridgham et al., 2008), il est important de mieux comprendre comment ces états sont atteints et quelles forces évolutives les favorisent. Dans ce memoire, je cible ces questions avec des simulations in silico de l’évolution des protéines suite à la duplication de gènes en travaillant avec des structures crystallographiques de haute qualité, provenant de la Protein Data Bank (Berman et al., 2000; Dey et al., 2018). Les simulations montrent que les sous-unités et interfaces partagées entraînent une forte corrélation entre les trajectoires évolutives de ces complexes. Ainsi, les simulations prédisent que la préservation de seulement les deux homomères ou seulement l’hétéromère ne devrait pas être fréquente. Toutefois, la simulation qui applique la sélection seulement sur un homomère montre que l’homomère neutre est destabilisé plus rapidement que l’hétéromère neutre. Nous avons comparé ces prédictions avec des résultats expérimentaux du réseau d’interactions protéine-protéine de la levure. Comme suggéré par les simulations, les patrons d’interactions les plus fréquents ont été la formation des trois complexes (deux homomères et un hétéromère) ou la formation de seulement un homomère. Les patrons correspondants à deux homomères sans hétéromères ou un hétéromère sans homomères sont rares. Nos résultats démontrent l’extension de l’hétéromérisation entre paralogues dans le réseau d’interactions physiques protéine-protéine de la levure, les mécanismes sous-jacents et ses implications. / Gene duplication is one of the most important evolutionary mechanisms for the generation of functional diversity. When a gene is duplicated, the new copy shares all of the ancestral copy’s functions because they encode identical proteins. Therefore, the two proteins, called paralogs, will have the same protein-protein interaction network. However, in the case of the duplication of genes encoding proteins that self-interact (homomers), the new protein will also interact with the ancestral copy, introducing a novel interaction (heteromer) (Kaltenegger and Ober, 2015; Pereira-Leal et al., 2007). As these interactions can have different retention and functional patterns (Ashenberg et al., 2011; Baker et al., 2013; Boncoeur et al., 2012; Bridgham et al., 2008), it is important to understand better how these states are reached and what evolutionary forces favor each of them. In this thesis, I approach these questions by means of in silico simulations of protein evolution after gene duplication by working with high-quality crystal structures from the Protein Data Bank (Berman et al., 2000; Dey et al., 2018). The simulations show that the shared subunits and interfaces lead to these complexes having highly correlated evolutionary trajectories. Thus, the simulations predict that the preservation of only the two homomers or only the heteromer is not likely to happen often. Nevertheless, simulating evolution with selection on only one homomer shows that the neutral homomer is destabilized faster than the neutral heteromer. We compared these predictions against experimental results from the yeast protein-protein interaction network. As suggested by the simulations, the most abundant interaction patterns were either the formation of all three complexes (two homomers and one heteromer) or the formation of only one homomer, with motifs corresponding to two homomers without a heteromer or a heteromer without homomers being rare. Our results highlight the extent of heteromerization between paralogs in the yeast protein-protein interaction network, the underlying mechanisms, and its implications